一步生成条件性基因敲除小鼠ESC

　　最近发展的基因组编辑工具，包括转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas9，使我们能够通过诱导双链断裂（DSBs）的非同源末端连接（NHEJ）修复，快速而有效的敲除靶向基因。然而，这种方法不能进行必需基因的功能研究，这类研究通常采用的策略是基于Cre-LoxP系统的条件性基因敲除（cKO）。

　　这就需要通过同源重组（HR）和诱导Cre重组酶表达，进行loxP位点的靶向整合（敲入）。Cre融合蛋白和 人类雌激素受体ERT2的突变配体结合域，常用于4-羟基他莫昔芬（4OHT）对Cre重组酶活性的控制，4OHT可促进CreERT2从细胞质到细胞核 的易位，在那里Cre可识别和重组嵌入基因组DNA的loxP位点。4OHT控制的基因敲除，不仅能让我们选择一个时间窗，在一个必需基因表现出其致命表 型之前，研究它的功能，而且也能让我们评估一个基因缺失的直接影响。

　　产生诱导型CKO小鼠胚胎干细胞（mESCs） 的传统方法是非常费时、费力的，需要产生和杂交携带靶向cKO（两端各放一个loxP序列）等位基因的小鼠。最近，在小鼠受精卵中Cas9刺激的、含 loxP的单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）的整合，可简化CKO mESC的生产，但仍然依靠使用活体动物。为了遵循减少使用实验动物的原则，简化并加快CKO MESC的生产过程，研究人员一直都在试图提高工程核酸酶介导的HR事件，这将允许直接向mESCs插入LoxP位点。

　　七月十四日，来自瑞士巴塞尔大学、Friedrich Miescher生物医学研究所的研究人员在Cell子刊《Cell Reports》发表一项研究成果，题为“Single-Step Generation of Conditional Knockout Mouse Embryonic Stem Cells”。这项研究介绍了一种新的报告系统，可让我们一步实现高效的CKO mESCs体外生成，也能进行双等位基因的内源基因标记。

　　在这项研究中，研究人员开发了体外产生无标记cKO mESCs和内源基因标记的试剂和流程。这种方法是基于重组报告质粒，它们赋予了EGFP荧光性或嘌呤霉素对工程核酸酶诱导的DSB修复的抗性。不同于先 前公布的报告系统——依赖于容易出错的DSB NHEJ修复，这种新的报告系统，仅在HR修复后变得功能性，从而同时报告工程核酸酶的活性和HR通路的活性。

　　这种新方法首次使我们能够在一次转染步骤中，直接在mESCs的外显子双等位基因两侧各放一个LoxP位点。利用这种已确立的父母RosaC (Rosa26CreERT2/-)细胞系，任何配备基本细胞培养和分子生物学设备的实验室，可在不到3周的时间内，获得CKO mESCs。

　　与TALEN或CRISPR/Cas9核酸酶通常所诱导的靶基因敲除相比，cKO策略使我们能够对必需基因进行功能缺失分析。它也排除了对观察到的 基因敲除表型的误解，这些表型可能是由TALEN或Cas9基因组编辑相关的潜在脱靶效应引起的。这种选择程序的瞬态性质，可避免选择标记的基因组插入， 使我们能够在同一细胞系中产生多个cKO等位基因。

　　最后，作者强调，虽然他们建立了与TALENs和mESCs相结合的重组报告系统，但它可能同样也与CRISPR/cas9系统强劲结合，并在多种细胞类 型和生物体中使用。当基因组靶位点的序列特性不能使用一种可用的基因组编辑系统时，灵活地选择一种特殊的基因组编辑核酸酶，将是特别重要的。