一种关于治疗手足口病的双特异性抗体的研究

　　手足口病（HFMD）是由肠道病毒引起的疾病，引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16（CA16）是手足口病的主要致病因子，可导致严重的中枢神经系统并发症。最近针对EV71病毒感染的疫苗和抗体的开发取得了突破性的进展，然而，针对EV71和CA16同时感染的情况，仍没有有效的二价疫苗或双特异性抗体（BsAb）。

　　目前有研究将双特异性抗体应用于针对DENV、HBV和ZIKA感染的疾病，发现存在有效的治疗结果。双特异性抗体可以同时结合两个不同的表位，在靶细胞和效应分子或细胞之间建立桥梁，具有许多潜在的优势，如更好的募集效应细胞，以加强杀伤作用；相对联合治疗具有协同作用；有利的药物经济学和降低成本等。

　　近年来，研究人员已经开发了多种重组方法应用于生产不同形式的双特异性二价/多价抗体片段，如BiTE（双特异性T细胞接合者）、DVD-IgG（双特异性T细胞接合者）、scFv-IgG（scFv融合到κ轻链/重链末端）、CrossMab（替换重链的CH1结构域）和Bs(scFv)4-IgG（两种不同的scFv分别与CH/CL的N-末端融合）。

　　基于上述理论，研究人员开发了两种具有高中和活性的单克隆抗体，1：CT11F9mAb，针对EV71病毒感染；2：NA9D7mAb，针对CA16病毒感染，在这两种抗体的基础上，构建两种新型四价双特异性IgG抗体，研究人员通过应用DVD-IgG和Bs(scFv)4-IgG的构建方法消除抗体重链和轻链之间的错配，以产生均一的双特异性IgG样抗体产物，通过体外活性研究和小鼠体内活性研究，分析该双特异性抗体是否有效，为HFMD的治疗提供新的方案。

　　1. Bs（scFv）4-IgG和DVD-IgG双特异性抗体结构

　　研究人员将两种高中和活性的肠病毒抗体CT11F9mAb和NA9D7mAb，通过重组构建成Bs(scFv)4-IgG和DVD-IgG 形式的双特性抗体，分别为Bs(scFv)4-IgG-1、Bs(scFv)4-IgG-2、DVD-IgG-1和DVD-IgG-2（图1A,B）。

　　将四种形式的BsAb质粒DNA通过瞬时转染的方法转入到CHO悬浮细胞中，表达七天后离心分离上清，使用蛋白A层析对上清进行分离纯化。利用SDS-PAGE确认四种BsAb的纯度和大小，研究结果显示BsAb的纯度均大于95％。在还原条件下，Bs(scFv)4-IgG和DVD-IgG产生两条明显的条带，分子量为～65kDa（重链）和35kDa（κ轻链）（图1C）。在非还原条件下，可以看出Bs(scFv)4-IgG和DVD-IgG 的分子量约为200kDa（图1D）。

　　2. Bs（scFv）4-IgG和DVD-IgG双特异性抗体的结合活性检测

　　研究人员通过ELISA和免疫荧光（IFA）两种方法检测Bs(scFv)4-IgG和DVD-IgG的特异性结合能力（图2）。

　　首先通过ELISA比较四种BsAb与单一病毒的结合活性，如图2A所示，对于EV17病毒，Bs(scFv)4-IgG-1、Bs(scFv)4-IgG-2和DVD-IgG-1与EV71病毒的结合活性比CT11F9cAb强，而DVD-IgG-2与EV71结合活性较弱。对于CA16病毒，Bs(scFv)4-IgG-1和DVD-IgG-2抗体的结合活性优于NA9D7cAb，而Bs(scFv)4-IgG-2和DVD-IgG-1与CA16病毒的结合水平略低于NA9D7cAb（图2B）。

　　其次研究人员利用IFA检测四种BsAb与EV71或CA16病毒感染细胞的反应性。如图2C所示，Bs(scFv)4-IgG-1和Bs(scFv)4-IgG-2显示出与EV71和CA16的良好反应性，然而DVD-IgG-1和DVD-IgG-2与亲本抗体结果相似，只与一种病毒发生反应。针对ELISA和IFA的检测结果，Bs(scFv)4-IgG-1比其他三种双特异性抗体对EV71和CA16病毒的结合活性都要好，研究人员认为，这可能是重组抗体的灵活性和构象差异导致的结果，通过优化scFV或可变结构域的位置和方向可以保留其单抗原有的病毒结合能力。

　　3. Bs(scFv)4-IgG-1体外中和试验

　　为了研究双特异性抗体对EV71/52-3或CA16/190病毒的交叉中和活性，研究人员对RD细胞进行了体外微量中和测定，以嵌合抗体（CT11F9cAb和NA9D7cAb）和亲本mAb（CT11F9mAb和NA9D7mAb）作为对照，结果显示，双特异性抗体DVD-IgG-1和DVD-IgG-2与对照组结果类似，都只能中和其中一种病毒，EV71/52-3或CA16 / 190，而Bs (scFv)4-IgG-1和Bs(scFv)4-IgG-2能有效的中和两种病毒（EV71/52-3、CA16/190），其中Bs（scFv）4-IgG-1对CA16/190病毒的中和活性最高，是Bs(scFv)4-IgG-2的3倍。

　　针对Bs（scFv）4-IgG-1显示出的优异结果，研究人员进一步评估Bs（scFv）4-IgG-1对其他的EV71（pSVA/B3、05535/B5、03149/C2和02969/C5）和CVA16（213a/B1b和4430/B1b）菌株的交叉中和能力。如图3所示，Bs(scFv)4-IgG-1可有效中和B3、B5、C2和C5亚基因型的EV71菌株和B1b亚基因型的CVA16菌株，IC50值范围为0.21～2.53mg/mL，以上结果说明针对EV71和CA16病毒，Bs(scFv)4-IgG-1是一种有效的交叉中和剂。

　　4.评估 Bs(scFv)4-IgG-1体内抗感染能力

　　使用感染EV71、CA16和EV71+CA16病毒的新生小鼠模型来评估双特异性抗体Bs(scfv)4-IgG-1的抗感染能力。

　　如图4所示，在EV71病毒攻击试验中，NA9D7mAb和PBS组的新生小鼠在4dpi时开始出现疾病，并且均在10dpi内死亡，而使用抗体剂量为10μg/g、3μg/g或1μg/ g的Bs(scFv)4-IgG-1或CT11F9mAb处理的小鼠均能存活（图4A,D,G）。

　　在CA16攻击试验中，CT11F9mAb和PBS组的小鼠在10dpi内死亡，而使用抗体剂量为10μg/g或3μg/g的Bs(scFv)4-IgG-1或NA9D7mAb可以完全保护小鼠免受CA16感染，没有明显的临床症状，抗体剂量为1μg/g时仅有80％的小鼠免于感染（图4B,E,H）。

　　在EV71和CA16共感染试验中，PBS对照组中的小鼠在3dpi时发病，并且均在8dpi内死亡（如图4C,F,I），而使用抗体剂量为10μg/g或3μg/g的Bs(scFv)4-IgG-1或NA9D7mAb+CT11F9mAb混合抗体，结果显示都能较好的保护小鼠免受EV71和CA16的感染，存活率为100%，抗体剂量为1μg/g时，注射Bs(scFv)4-IgG-1的小鼠存活率为700%，注射NA9D7mAb+CT11F9mAb混合抗体的小鼠存活率为80%，以上结果说明在EV71和CA16单一病毒感染或混合感染的情况下，Bs(scfv)4-IgG-1均具有显着的治疗效果。

　　总结：研究人员构建了四种形式的双特异性抗体，分别为Bs(scFv)4-IgG-1、Bs(scFv)4-IgG-2、DVD-IgG-1和DVD-IgG-2，通过ELISA和FIA分别检测与两种病毒的结合活性，结果显示Bs(scFv)4-IgG-1与EV71、CA16病毒的结合水平最高，然后进一步研究双特异性抗体Bs(scFv)4-IgG-1体外中和试验以及评估小鼠体内抗感染能力，其结果进一步说明了，针对EV71和CA16病毒，Bs(scFv)4-IgG-1是一种有效的交叉中和剂，且能保护新生小鼠免受EV71和CA16病毒的攻击。

　　参考文献：Bing Zhou, Longfa Xu, et al. Bispecific broadly neutralizing antibody against enterovirus 71 and coxsackievirus A16 with therapeutic potential, Antiviral Research (2018).doi: https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2018.11.001.