三维冷冻电镜技术

三维冷冻电镜技术
冷冻电镜经过近三十年的发展,。冷冻电镜技术已成为研究生物大分子结构与功能的强有力的武器。这种方法采用高压快速液氮冷冻方法使样品包埋在玻璃态的水环境中，这种环境接近于生理状态，减少了样品在制备过程中的结构破坏，使我们能够观察到生物大分子在天然状态下的结构。同时冷冻的速度极快，这就有可能把细胞在其生理活动（例如，肌肉收缩）的某些特定时刻固定下来，并进而显示此时的结构特点，进而可通过不同功能状态的瞬时构像变化来研究生物分子的功能。冷冻电镜获得的是处于天然状态下未经染色的分子的二维投影像。将样品进行不同角度的倾斜所获得的数据进行综合分析，并依据样品的不同特性使用不同的重构技术获得分子的结构。。由于样品未经染色，很容易受到电子束的损伤。将样品快速冷冻（样品处于玻璃态）并在低温下观察样品，一定程度上可以减少电子束对样品的损伤，因此称为冷冻电镜。为了使样品能够在整个成像过程中受到的辐射总剂量损伤最小，而又能产生可分辨的图像，大约只有10-20e/ 2（液氦温度下：4.3K）或5e/ 2（液氮温度下：77K）可以用来成像，这样低的辐射剂量会导致图象信躁比（SNR）较低。因此要获得大量的图象来进行矫正和平均以增加SNR从而获得结构信息。场发射枪的应用提高了原始数据的质量，新的计算机软件的应用使远距离显微操做和记录成为可能。电子晶体学，单粒子法，电子断层成像技术分别针对较小的对称结构，较大的不对衬结构和更大的亚细胞结构进行三维重构和功能研。