上海生科院等建立“类精子细胞”的单倍体细胞系

　　2012年，中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所李劲松研究组与徐国良研究组合作从小鼠的精子中建立了孤雄单倍体胚胎干细胞，并证明这些细胞能够代替精子使卵母细胞“受精”产生半克隆小鼠，该项研究成果成功入选2012年中国科学十大进展。然而，单倍体细胞随着体外培养传代，特别是经过遗传编辑后，逐渐丢失了产生半克隆小鼠的能力。

　　2015年7月10日，国际学术期刊《细胞干细胞》（Cell Stem Cell）在线发表了李劲松研究组的最新研究成果，他们建立了能稳定支持半克隆小鼠出生的“类精子细胞”单倍体细胞系，并证明这些细胞能携带CRISPR-Cas9文库一步产生大量携带不同突变基因的小鼠。该成果填补了哺乳动物在个体水平上进行遗传筛选的空白，为遗传发育研究提供新的体系。

　　能代替精子细胞使用的单倍体细胞系的建立为获取遗传编辑的动物模型提供了一种新的手段。然而，之前的研究显示，半克隆小鼠的出生效率低（4.5%左右），而且约一半的半克隆小鼠出现发育迟缓的现象。分析原因发现，原本在精子细胞中不表达的雄性印记基因H19在单倍体细胞和发育迟缓的半克隆小鼠中出现高表达的现象，这暗示印记基因的异常表达可能是导致半克隆小鼠胚胎发育异常的关键原因，通过调控印记基因的表达有可能提高半克隆小鼠的出生效率。

　　为了验证这一假设，研究人员从H19-DMR敲除的小鼠精子中建立了单倍体细胞系（H19-DMR敲除后，H19的表达下降），发现将这些细胞注入卵子中后能显著提高半克隆小鼠的出生效率（达到8.7%）。然而，仍然有三分之一的半克隆小鼠出现发育迟缓的现象。进一步分析原因发现，在H19-DMR敲除的细胞和发育迟缓的半克隆小鼠中存在另外一个雄性印记基因Gtl2的异常高表达。为此，研究人员进一步在H19-DMR敲除的单倍体细胞中敲除了调控Gtl2表达的IG-DMR（IG-DMR敲除后，Gtl2表达下降）。令人惊奇的是，H19-DMR和IG-DMR敲除的细胞能高效产生半克隆小鼠，达到22%的出生效率，并且几乎不会产生发育迟缓的半克隆小鼠。为了进一步验证这一结果，研究人员在原本已经失去产生半克隆小鼠能力的单倍体细胞中敲除了H19-DMR和IG-DMR后发现细胞又恢复了产生半克隆小鼠的能力，并且能达到17%的效率。这些结果证明，H19-DMR和IG-DMR是单倍体细胞获得“受精”能力的两大障碍，将这两个障碍去除后，能够产生高效支持半克隆胚胎发育的单倍体细胞。

　　“类精子细胞”的单倍体细胞系的建立使得利用这一细胞快速制备遗传编辑小鼠模型成为可能。为此，研究人员先后在H19-DMR和IG-DMR敲除的单倍体细胞中进行了多基因的敲除和敲入，建立了携带Tet1/Tet2/Tet3三基因敲除、P56/P63/P73三基因敲除以及Tet1-EGFP/Tet2-mCherry/Tet3-ECFP三基因敲入的细胞系，并证明这些细胞能稳定高效支持半克隆小鼠的产生。

　　最近，CRISPR-Cas9文库被应用到人和小鼠的细胞中进行了全基因组水平的遗传筛选。研究人员进一步推测，如果H19-DMR和IG-DMR敲除的单倍体细胞能够携带CRISPR-Cas9文库，让单个的细胞携带一个sgRNA和Cas9核酸酶，通过注入卵子中则可以批量产生携带不同突变基因的半克隆小鼠，从而使得小鼠个体水平的遗传筛选成为可能。通过实验，研究人员验证了这一设想，从而填补了在哺乳动物个体水平进行遗传筛选的空白，为遗传发育研究提供了新的体系。

　　钟翠青、尹奇、谢振飞、白梅竹和董瑞为该文的共同第一作者，李劲松、吴宇轩和中科院-马普学会计算生物学伙伴研究所的研究员杨力为该文的通讯作者。参与该研究的合作单位和人员包括中科院上海生命科学信息中心研究员李党生、宾夕法尼亚大学的Bartolomei和剑桥大学的Ferguson-Smith等，工作得到了国家科技部、国家基金委、中国科学院（干细胞先导专项）以及上海市科委经费的支持。

通过H19-DMR和IG-DMR的敲除，孤雄单倍体胚胎干细胞可以获得类似球形精子的特性，以此获得大量的半克隆小鼠。在此基础上，可以将这种双敲的孤雄单倍体胚胎干细胞运用于获得多基因敲除和敲入的杂合小鼠。更进一步发现，结合CRISPR-sgRNA文库，可以一步产生不同的基因突变小鼠。