上海生科院：用CRISPR靶定DNA去甲基的新方法

　　在哺乳动物细胞中，DNA甲基化精密地调节基因的表达，从而在许多生理和病理过程中起着举 足轻重的作用。近期，来自中科院上海生命科学研究院“百人计划“胡荣贵研究员带领的研究小组，在《Cell Discovery》发表题为“A CRISPR-based approach for targeted DNA demethylation”的研究成果，报道了一种新的方法，采用目前广泛使用的CRISPR-Cas系统来靶定DNA去甲基化。

　　DNA甲基化是向DNA添加甲基的一个后生过程，主要发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶碱基的第五个碳上。在哺乳动物细胞中，DNA甲基化调控着基因的 表达，从而在无数的生理和病理过程中发挥关键的作用，其中包括，但不限于，细胞发育和分化、基因组印迹和肿瘤发生。通常，肿瘤抑制基因中的DNA甲基化， 会沉默它们的表达，并将有助于多种类型的人类癌症。另一方面，DNA甲基化也是许多毁灭性的人类神经肌肉疾病的病因，包括脆性X染色体综合征，其中 FMRP的启动子区中三核苷酸重复（CGG）的扩增，可导致基因的超甲基化，并大幅抑制该基因的表达。因此，操纵靶基因DNA甲基化状态的技术进步，不仅 有助于我们理解DNA甲基化如何在特定背景下调节基因的表达，而且能控制基因表达，并可能带来有益的临床预后。

　　最近，有研究发现许多酶能够以不同的机制催化活性的DNA去甲基化。据报道，Tet加双氧酶催化的5-甲基胞嘧啶氧化，可促使具有Tet催化结构域（Tet-CD）的DNA去甲基化，作为最小的功能模块。研究人员曾尝试利用转录激活因子样效应物-融合的TET1-CD靶定DNA去甲基化，来激活靶基因。然而，它更广泛的作用被限制为基于转录激活因子样效应物的策略，需要繁琐的设计和组装，从而不适合于高通量应用。

　　近年来，CRISPR系统已被广泛应用于基因组工程与编辑。利用失活的核酸内切酶 Cas9（dCas9），开发的合成生物学平台已经实现了基因调控、基因组编辑或荧光标记。此外，在sgRNA中意外发现的可塑性，可使额外的RNA元件 插入形成sgRNA2.0系统。一般而言，这种RNA元件可被许多RNA特异结合蛋白效应物识别，这将可能导致靶向dCas9介导的功能基团的效力放大。

　　在这项研究中，研究人员报道了一种新的方法，利用CRISPR-Cas9系统，靶定DNA去甲基化。最初，研究人员通过向传统sgRNAs中插入两个拷贝的噬菌体MS2 RNA元件，构建了修改的单导向RNAs（sgRNAs）（sgRNA2.0），这将有利于Tet1催化结构域（TET CD），与dCas9或MS2外壳蛋白融合，结合到基因位点。

　　随后，研究人员证明，该系统可显著上调靶基因的转录，包括RANKL、MAGEB2或MMP2，这与它们邻近的启动子中的CpG的DNA去甲基，是 密切相关的。此外，dCas9/sgRNA2.0指导的去甲基化系统，似乎能提供有效的靶基因去甲基化，但是具有脆弱的脱靶效应。该系统的应用，不仅可以 帮助我们理解“在具体背景中DNA甲基化如何可以调节基因表达”的机制，而且也使我们能够控制基因表达，并带来潜在的临床益处。