上皮细胞培养

　　1）表皮细胞培养

　　1．取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5～1平方厘米小块。

　　2．EDTA处理：先置入0.02%EDTA中室温置5分钟。

　　3．冷消化：换入0.25%胰蛋白酶中，置4℃过夜。

　　4．分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。

　　5．温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25%胰蛋白酶中，37℃再消化30～60分钟。

　　6．用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液。

　　7．培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20%小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2温箱培养。

　　2）乳腺组织培养

　　直接培养法：（适于培养含纤维少的软组织）

　　1．在含有少量培养液或Hanks液的容器中，用锋利刀片将组织反复切割成碎块。

　　2．把组织碎块连同液体注入离心管中，再补加少许培养液，用吸管吹打片刻，置试管架3～5分钟。吸除上层液可排除非乳腺细胞部分。重复2～3次。

　　3．末次处理结束后，向沉降管中再补加培养液，用吸管稍吹打，使沉降物重悬。不待细胞团块下降立即通过3～4层无菌纱布滤入另管中。

　　4．调整好适宜密度，接种入培养瓶中培养。

　　胶原酶消化法：（适于处理含纤维多的较硬组织）

　　其过程与培养其它组织相同。

　　3）胃上皮细胞培养

　　1．取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许。

　　2．清洗：用含庆大霉素（400微克/毫升）和二性霉素（2微克/毫升的Hanks）液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm3大小。

　　3．消化：在I型胶原酶和透明质酸酶中，于37℃中消化80分钟。

　　4．离心：收集细胞悬液，800转/分离心后，Hanks液漂洗两次。

　　5．接种：末次离心后加入含有1%～2%胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中，接种量依不同实验目的而定。

　　4）肝细胞培养

　　初代组织块培养：取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3左右的小块，采用帖壁培养法。

　　5）内皮细胞培养

　　1．取产后的新鲜脐带。如不立即培养可以保存于4℃中，但不宜超过12小时。无菌剪取长10～15厘米一段。其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用于培养。

　　2．先用三通注射器吸温PBS液注入脐带的静脉中，洗除残血，注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流。

　　3．用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1%的胶原酶，待末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，消化3～10分钟。

　　4．吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中，为获取更多细胞，可再注入温PBS冲洗2～3次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心。

　　5．吸除上清，加1640培养液，制成细胞悬液，接种入瓶皿中培养，顺利时2～3天内细胞即可长成单层。

　　6）毛细血管内皮细胞培养

　　肿瘤条件培养基制备：

　　1．取C3H小鼠的S-180实体肉瘤组织。

　　2．胰蛋白酶消化，Dulbecco改良Eagle氏培养液15ml（含10%小牛血清），接种到T-75 Falcon产培养瓶中培养。

　　3．在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基；再用含10%小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，可获得多量条件培养。

　　4．4000转/分离心后，再通过0.22μm微孔滤膜滤过，－20℃冻存备用（临用前融解）。