上皮细胞类培养实验

实验方法原理 利于皮肤表皮细胞培养成功的因素有，在有胶原的底物上易生长；另有人发现把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3 细胞为饲养层（用射线照射后）上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低pH、Ca2+的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。向培养基中加氢化可的松（ 10 μg/ml ）、10-10 的霍乱毒素、10M-6 的异丙基肾上腺素（Isopro-terenol）和10 ng/mI 促表皮生长因子（EGF）能促表皮细胞生长。

实验材料 皮肤血清

试剂、试剂盒 EDTA胰蛋白酶Eagle

仪器、耗材 血管钳吸管CO2温箱

实验步骤

皮肤是皮表细胞培养来源，小儿包皮是皮肤表皮细胞培养的好材料。全皮培养时，表皮细胞与成纤维细胞混合生长，难以纯化。黑木登志夫（1981）用皮肤表皮和真皮分离培养法可获纯上皮细胞，有一定参考价值，其法如下：

1.  取材

取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成 0.5~1 平方厘米小块；

2.  EDTA处理

先置入0.02 %EDTA 中室温置5 分钟；

3.  冷消化

换入0.25 %胰蛋白酶中，置4 ℃过夜；

4.  分离

取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；

5.  温消化

取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25 %胰蛋白酶中，37 ℃再消化30~60 分钟；

6.  用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液；

7.  培养液

通过80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和 20 %小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2温箱培养。

注意事项

冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散，如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散，此时亦可直接置入PBS中用吸管吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。

其他

皮肤表皮培养亦可用全皮消化法或组织块培养法培养。用胶原酶消化为好，它对结缔组织有较强消化作用，对表皮细胞损伤小，但成纤维细胞易与上皮细胞同时生长，在这种情况下，需做排除成纤维胞处理。血清中含有血小板来源的生长因子（PDGF），易促成纤维细胞的生长；如用好的、不含PDGF的无血清培养基培养可能更好。