上皮细胞类培养实验_胃上皮细胞培养实验

培养人正常胃上皮细胞获得成功主要在于摸索到了适于胃上皮细胞生长的条件，它们主要是

1.  胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞；

2.  应用胶原底物培养；

3.  制备含有特定成分的培养基。

细胞

胰岛素转铁蛋白胶原酶

培养基离心机滤膜

一、培养条件的准备

1.  基础培养基

DME/F12（Sigma 产），加庆大霉素100 U/ml，pH7.4

2.  完全培养基

（1）在基础培养基中再附加相关促细胞生长因子和其它成分
 

胰岛素（Sigma 产） 5 μg/ml

转铁蛋白（Sigma 产） 10 μg/ml

新生牛脑提取物  10 μg/ml
 

（2）新生牛脑提取物制法

①取新生牛脑垂体110 g/mlHEPES缓冲液匀浆；

②10000 转，离心20 分钟，取上清；

③水中透析2 天，透析袋为#08667B（Fisher 产）；

④10000转，离心20 分钟，取上清；

⑤0.22 微米微孔滤膜滤过除菌，-70 ℃贮以备用。

3.  细胞外基质（ECM）
 

IN型胶原 8 μg/ml

纤粘连蛋白 10 μg/ml

层粘连蛋白 8 μg/ml

多聚赖氨酸 0.001 ％

酵母提取物（Sigma） 5 ％

将以上混合物用弯头吸管涂于塑料培养皿表面

4.  消化酶
 

I型胶原酶（Sigma） 0.5 ％（用DME配）

透明质酸酶（Sigma） 0.5 ％（用DME配）

二、培养程序

1.  取材

取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许；

2.  清洗

用含庆大霉素（400 μg/ml）和二性霉素（2 μg/ml的Hanks）液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1 mm³大小；

3.  消化

在I型胶原酶和透明质酸酶中，于37 ℃中消化80 分钟；

4.  离心

收集细胞悬液，800 转/分，离心后，Hanks液漂洗两次；

5.  接种

末次离心后加入含有1 %~2 %胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中；接种量依不同实验目的而定。

细胞接种后一般在16 小时内贴壁，细胞呈多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接成片。初代培养可维持2~3 周，第一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。

一、讨论

胃上皮细胞培养中证明，多加血清并不能提高促细胞生长作用，是因血清中除含有促细胞生长的PDGF因子外，也含有TGF-β1。我们研究证明TGF-β1有抑制上皮细胞生长作用。但因完全培养基中含有较多促上皮生长因子，仍利于上皮细胞生长。上皮细胞生长对ECM有依赖性，其中以N型胶原对胃上皮细胞作用更好。