不同分光光度计间细菌光密度测定的差异分析

背景

细菌培养基的光密度（OD）测定是微生物学中使用的一种常见技术。研究人员主要依靠分光光度计来进行这些测定，然而实际上这个测定是基于培养基的光散射量而不是光吸收量。在其标准配置中，分光光度计并未对光散射测定进行优化，这通常会导致仪器间所测得吸光度上的差异。

方法

该研究调查了不同的分光光度计光学配置对在分批培养基中生长的大肠杆菌JM109光密度测定的影响。分光光度计检测包括了使用阵列检测的反向光学系统、基于单色器的传统系统以及一种配备积分球配件（ISA）的单色器系统。在每个仪器上测定OD600生长曲线，同时，对McFarland进行CFU/mL计数来进一步对每个光学系统进行鉴定。

结果

来自相同光学配置类别的分光光度计其OD数据是相当的。用反向光学系统测定较高OD时数据变化更大，这是由较低杂散光所导致。基于单色器的系统测试较高OD时准确度较高，主要是因为与来自反向光学系统的多色光相比，单色光具有更好的杂散光去除能力。然而，反向光学系统测定OD时却有具有良好的动态范围。使用ISA产生出的数据与用其它系统产生出的数据不同，这是因为其具有捕捉几乎所有前向散射光的能力。而对McFarland标准品的测定确认了这些现象。

结论

分光光度计进行可靠的光散射测定的能力在很大程度上取决于其光学配置；因此，具有不同光学配置的分光光度计会呈现出不同的OD测定值。理想状态下，高度散射样品（如细胞培养基）的吸光度是使用ISA进行测定的，目的是为了捕捉几乎所有的散射光。培养基生长可使用OD600测定，然而每当改变分光光度计时，就应该计算和应用一个换算因数。

引言

培养基中细菌生长（迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期）各个阶段都能记录下来，其中对数期被认为是细菌分裂最快的阶段（1）。使用分光光度计测定细菌培养基在600nm（OD600）时的光密度，从而监控细菌生长一直是微生物学中的一种核心技术。使用细菌OD600的三种更为常见的应用如下：（a）在细菌表达蛋白质时，找到诱导蛋白的佳时间，（b）用于小抑菌浓度（MIC）实验的接种体浓度的确定和标准化，和（c）收获和制备感受态细胞的时间的确定。研究人员继续依靠分光光度计进行这些OD测定。然而，光密度不是一个吸光度指标，而是细菌混悬液的一种光散射指标，将其自身作为吸光度显示（图1）。分光光度计光学配置对光密度测定的影响得到了很好的记录（2-4）。具有不同光学配置的仪器对同一细菌混悬液测定得到了不同的光密度。分光光度计光学配置上的差异对观察到的差异影响。前向光学系统采用单色光来进行吸光度的测定，而反向光学系统则利用多色辐射进行测定，光在其穿过样品后再区分成单独波长（图2）。前向光学系统的一些要素导致了测得OD值上的差异：（a）样品与检测器之间的距离，（b）聚光透镜的尺寸和焦距大小不同，和（c）检测器的面积和灵敏度（5）。尽管现在都知道不同的光学配置会产生不同的OD值，但是研究人员仍继续关注在不同分光光度计间发现的OD值差异。在本研究中，我们分析了多种光学配置分光光度计测出的OD值差异。我们在分批培养基中培养大肠杆菌JM109，并监控OD达9.5小时。在测定之前稀释培养基，并将由于不同分光光度计光学元件差异造成的不同OD值进行换算。

结果

从未稀释和稀释的培养基中收集的OD600数据如图3所示。将来自稀释溶液的OD600值乘以稀释因数，并与未稀释的样品进行对比。两张图的分歧表明，不同的光学配置在光密度测定方面会有不同的动态范围。当对比每个分光光度计的校正OD值与细胞计数时，我们发现，随着时间的推移，具有相似光学系统的仪器产生了相似的OD曲线（图4）。具有前向光学系统，但却是双光束光学几何结构的BioMate 3S，与仪器组的差异大。McFarland数据呈现出一种与大肠杆菌生长相似的曲线（图5）。ISA使用McFarland标准品产生了更低的光密度（图6）。

图1结论

·计算OD测定值时，确定您所用分光光度计的光密度性能和动态范围是至关重要的。为获得有关生长曲线的最准确信息，稀释细胞混悬液是很重要的。

·OD测定在很大程度上取决于光学系统和几何学。对于相同的混悬液，具有不同光学系统和配置的分光光度计会读出不同的OD值。例如，在反向光学系统Evolution Array和前向光学系统，双光束BioMate 3S之间有实质性的分歧。

 ·积分球配件（ISA）可捕捉几乎所有的前向散射光，从而产生了更低的光密度。这是因为通常看起来被

样品吸收的散射光实际上是被ISA配件所收集。ISA对测定高度散射溶液中分析成分的吸光度是理想之选；然而，在测定细胞混悬液的光密度时，其是无效的。

·最后，我们提出了如何计算一个可用于使OD数据标准化，以便能在不同分光光度计间进行适当比较的换算因数。值得注意的是，这个换算因数是针对一种特定的有机体，因为微粒的尺寸和形状会影响换算因数。