不同植物SBPbox基因家族的比较分析

实验概要

本研究利用生物信息学资源和工具，对双子叶和单子叶模式生物拟南芥和水稻中的SBP-box基因家族进行了比较分析。利用两个物种的SBP-box基因编码的蛋白质序列构建了系统发生树。在系统发生树的末端节点上鉴定出12对旁系同源基因。利用非同义替换率与同义替换率(KalKs)分析了同源基因分离之后所经历的环境选择压力。此外还搜索了EST数据库以分析拟南芥和水稻中SBP-box基因的组织特异性表达。

实验原理

SBP-box基因家族是植物特有的转录因子基因家族。这类基因编码的蛋白质序列中包含一个高度保守的SBP结构域，并能够特异结合在植物花分生组织识别基因SQUAMOSA及其同源基因的启动子区段，以调控其表达。

实验步骤

1. 拟南芥和水稻基因组中SBP-box基因的鉴定

在TAIR数据库(http://www.arabidopsis.org)中获得拟南芥中已知的SBP-box家族基因编码的蛋白质序列。利用Pfam软件预测这些蛋白质中包含的SBP结构域。再利用这些SBP结构域区段序列作为检索序列，使用Blastp搜索TIGR拟南芥注释数据库(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/athl/)和TIGR水稻基因组注释数据库(http://rice.tigr.org/tdb/e2k1/osal/index.shtml。如果检索到的蛋白质序列符合E ≤10^-10，将被作为候选蛋白质序列。再利用Pfam工具鉴定这些候选蛋白序列中是否包含SBP结构域。若存在SBP结构域，则认为其属于SBP-box基因家族。新鉴定出的SBP蛋白质继续作为检索序列，检索以上数据库，直至没有新的序列检出为止。获得这些SBP-box基因家族成员的基本信息之后，从TIGR数据库中分别下载蛋白质、基因组和CDS序列。

2. 序列分析

SBP-box蛋白质的多序列联配采用Clustal X 1.83，参数为默认。系统发生树的构建也采用Clustal X 1.83，方法为Neighbor-joining，并采用bootstrapping分析评估所建立的系统发生树。系统发生树的显示利用软件Treeview 1.61。利用MEME程序(http：//meme.sdsc.edu/meme/intro.html)对拟南芥和水稻SBP-box基因家族成员鉴定保守性基序，除发现的最大基序数目为40外，其余参数为默认。为预测这些保守性基序的功能，对这些序列的一致性序列ScanPROSITE(http://expasy.org/tools/scanprosite/)检索PROSITE数据库中对应的功能性基序。

3. Ka和Ks的计算

从系统发生树中推断出拟南芥和水稻中旁系同源的SBP-box基因。旁系同源核苷酸序列的联配采用蛋白质联配作为向导，利用Clustal X 1.83软件进行。手工去除联配中的空位(gap)。利用K-estimator 6.1软件计算旁系同源基因的Ka和Ks值。

4. 基于EST的表达分析

为鉴定拟南芥和水稻SBP-box基因对应的EST序列，利用Blasm检索GenBank的EST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/dbEST/，该检索利用SBP-box基因的CDS序列作为检索序列。取匹配率大于95，长度长于160bp并且阈值低于10^-10的EST序列作为SBP-box基因对应的EST序列。并对这些序列按照组织序列来源进行归类。

5. SBP-box基因扩张模式分析

基因家族的扩张主要由三种方式，即大片段复制(segmental duplication)、串联重复(tandem duplication)和逆转录转座等随机性插入和重复事件。串联重复定义为出现在同一染色体区段的一个基因家族的基因。为验证片段复制对拟南芥和水稻基因组中SBP-box基因家族扩张的作用，本研究采取了两种方式对片段重复加以验证。首先根据TIGR对拟南芥和水稻基因组的注释结果，将所有的SBP-box基因定位于染色体上，并对比已经定义的染色体之间的片段重复(拟南芥基因组的片段复制：http：//www.tier.orb/tdb/e2k1/athl/Arabidopsis-genome duplication.shtml，水稻基因组的片段复制：http：//www.tigr.org/tdb/e2k1/osal/segmental dup/index.shtml)，查看SBP-box旁系同源基因对是否位于这样的重复片段中。其次，在一对旁系同源的SBP-box基因的两侧各取10个编码蛋白质的基因，通过Blast分析查看这两个染色体片段中除这对SBP-box基因外是否还存在其它的同源基因，若还存在其它的同源基因，则表明这对旁系同源的SBP-box基因是由于片段复制的结果产生的。