与Sanger测序齐名的另一种测序技术为何消失？

　　在20世纪70年代中期，两种直接测序DNA的技术被开发出来，其中一种是广为人知且沿用至今的Sanger双脱氧链终止方法，另一种是现在几乎被人遗忘的化学测序方法，Maxam–Gilbert测序。

　　这种测序方法是由美国哈佛大学的Walter Gilbert和他的学生Allan Maxam开发的。1980年，Frederik Sanger和Walter Gilbert因“在测定核酸碱基序列上的突出贡献”而分享了当年的诺贝尔化学奖。

　　事实上，Maxam–Gilbert方法一开始比Sanger测序更为流行，因为它可以测序双链DNA，而Sanger技术需要克隆后产生单链DNA。不过，随着新技术的出现，Maxam–Gilbert方法逐渐消失。

　　如何诞生

　　Gilbert曾经是一名物理学家，当他遇见James Watson后，开始对分子生物学感兴趣。Gilbert知道DNA序列携带了生命的密码，是从父母传递给后代，但在当时，人们根本不知道DNA序列是什么。

　　在60年代，Gilbert和他的同事完成了分离lac阻遏物的研究，这种蛋白质与DNA的特定区域结合。然后，他们尝试分离这段DNA区域。当蛋白与特定区域结合时，他们利用DNase酶来消化DNA的其他部分。lac阻遏物的结合保护了这一区域，使得他们成功分离。

　　不过，他们发现DNA测序方法的开发既困难，又费力。他们试图将DNA片段复制到RNA中，并设法通过酶分解以及电泳分离来测定RNA序列。这种方法似乎有效，不过极其慢，花了两年才确定24个DNA碱基，大约每个月一个碱基。

　　之后，一名俄罗斯人拜访了Gilbert，尝试说服他做一项实验：通过化学试剂来修饰与lac阻遏物结合的DNA。如果他们能够将DNA上的鸟嘌呤（G）甲基化，那么就有可能区分每个碱基。Gilbert认为这是一项艰巨的任务，前景渺茫。不过，半年后俄罗斯人又来了。

　　他们尝试用限制性内切酶来切割DNA，获得长度大约在100 bp的片段，然后在DNA片段的一端加上放射性标记。G的甲基化会影响它，使得DNA在这个点断裂。

　　“这无疑是一种测序方法。唯一的问题是你是否能够通过观察A和G来测序DNA？”Gilbert评论道。于是，他们又开始寻找化学试剂，来选择性地处理C或T。

　　Maxam–Gilbert方法最终于1975/76年诞生，那篇详细介绍它的文章于1977年发表在《美国科学院院刊》（PNAS）上。Gilbert的学生最终成功测序了长达5000 bp的质粒。

　　如何测序

　　Maxam–Gilbert测序方法的第一步是将选定的DNA片段变性成为单链，然后用放射性的磷32标记，通常在5’端。第二步是切割DNA链，利用哌啶和硫酸二甲酯来选择性攻击嘌呤碱基，利用联氨（肼）来选择性攻击嘧啶碱基。

　　通过使用不同的试剂组合，你可以选择性地切割DNA，让它在指定的地方断裂，比如C；C+G；G或G+A。将DNA样品上样到带有不同试剂的试管中，将产生不同的DNA片段。之后将这些片段上样到聚丙烯酰胺凝胶中，通过电泳区分DNA片段的大小。

　　在读取序列时，你需要从凝胶底部的小片段开始，然后依次推进。如果条带出现在G反应和G+A反应的泳道，那么这个碱基就是G。类似地，如果条带仅仅出现在G+A的泳道，那么它就是A。这个过程也同样适用于C和C+G泳道。

　　如何消失

　　尽管Maxam–Gilbert方法一度成为最流行的测序方法，但最终还是消失了，这其中有几个原因。首先，它相当耗时。整个过程涉及到多个步骤，它们本身都很耗时。其次，步骤越多意味着犯错的机会越大。如果出现错误，结果无法重复，那么错误排查也是一个大问题，需要花不少时间。

　　这种方法需要花几天的时间才能确认200-300个碱基，因此在规模放大时也遇到困难。考虑到人类基因组包含30亿对碱基，Maxam–Gilbert方法的消失也就不难理解了。就健康和安全而言，它也不是最佳的选择。需要用到大量的放射性物质，以及联氨这种已知的神经毒素。

　　相对而言，Sanger测序要简单一些。同时，其他技术也在快速发展。这一切使得Maxam–Gilbert化学测序方法最终失去了吸引力。到了20世纪80年代，Sanger测序成为人们的新宠。

　　Gilbert在开发测序方法时并没有预料到DNA测序终有一天将被用于全基因组的测序，直到1985年他应邀参加一个会议。

　　“我参加了那次会议，认为这是我听到的最愚蠢的事情。这比我们现在测序的东西要大得多。不过在会议上，考虑到技术所处的位置，我意识到还是有可能测序基因组的，然后我成了基因组测序理念的倡导者，”Gilbert说。

　　“在我开始测序时，每个月测一个碱基，如今是一个下午测数十亿个碱基。作为整个过程的参与者，我也觉得这不可思议。”

　　正如科学研究的各个分支一样，理论和技术的进化都是不可避免的。现在流行的技术，也许十年后已无人提及。不过，对于这种经典方法的消失，大家难免还是有一些失落和不舍。