专家指南：如何研究基因调控（一）

随着基因组学研究的深入，人们已经不再满足于了解基因的功能，而是对基因调控表现出愈加浓厚的兴趣。现在，我们知道，DNA甲基化和组蛋白修饰可调控基因，microRNA和非编码RNA也可以。基因调控的研究工具也越来越多，包括RNA-seq、ChIP-seq、ChIP-chip等。究竟该采用哪种方法来测定miRNA表达，如何确定这些RNA对基因调控的影响呢？《Genome Technology》特邀了一些这方面的专家，向大家介绍他们如何应对挑战，他们喜欢使用哪些软件，以及他们如何应用现有的工具。

Q1：检测非编码RNA和microRNA表达的最佳方法是什么？
Q2：您如何测定这些RNA对基因调控的影响？
Q3：为了确定表观遗传学因素对基因表达调控的影响，测定DNA甲基化或组蛋白修饰哪个更有用？为什么？
Q4：您采用什么方法来解决在ChIP-seq/ChIP-chip数据集中鉴定DNA motif的问题？
Q5：在定位蛋白-DNA相互作用时，为降低DNA污染和片段化所引起的假阳性，同时也避免太严格的数据过滤所引起的假阴性，您的主要方法是什么？
Q6：在ChIP-seq/ChIP-chip数据分析时，您首选的计算工具是什么？

Q1：检测非编码RNA和microRNA表达的最佳方法是什么？

Marc Facciotti（加州大学戴维斯分校）：

我主要研究微生物，因此我的答案多与微生物研究相关。

我想这个问题的答案取决于特定情况，您是否需要定量已知RNA的丰度，或发现新的ncRNA或microRNA。对于发现研究，特别是目前没有参考基因组时，RNA-seq似乎很合适。如果您研究一种具体的微生物分离株，目前已有基因组序列，那么高密度芯片可能非常有效。qPCR也是一个定向研究的选择。

Kun Huang（俄亥俄州立大学）：

对于筛查和发现研究，RNA-seq或smRNA-seq很理想。不过，研究人员应当特别注意提取RNA的步骤、文库制备和测序方法。对于已知microRNA的测定，定量方法如NanoString是个不错的选择。

Xiaole Shirley Liu（Dana-Farber 癌症研究所）：

在测定RNA水平时，可以采用RNA-seq或smRNA-seq。随着测序通量和多重分析的增加，它们变得比芯片便宜，也给出了更高质量的数据。为了测定转录速率，人们已开发出新的技术，如GRO-seq或NET-seq。这两种技术比RNA-seq略为复杂，但研究人员也正在优化和简化操作步骤。许多研究小组开始采用这些技术。在研究瞬时或动态转录变化时，它们提供了丰富的信息。

Jun Song（加州大学旧金山分校）：

新一代测序和芯片为检测非编码RNA和小RNA的表达水平提供了互补的方法。目前，一个可通过多重测序同时测定6个或更多microRNA样品的序列。另一个可设计定制tiling芯片，覆盖基因组中的非编码RNA。

Q2：您如何测定这些RNA对基因调控的影响？

Xiaole Shirley Liu（Dana-Farber 癌症研究所）：

在大多数情况下，我们希望了解转录因子或染色质调控因子的结合是否会影响基因调控。对于转录因子，我们常常观察到，结合的数量和强度越大，结合点与基因起点越接近，则转录影响越强。在表观遗传学上，基因表达似乎是激活和抑制mark之间的定量平衡。

siRNA/miRNA可在转录后调控基因，在过去十年中有大量工作是围绕于此。最近也发现了许多非编码RNA，它们在转录或表观遗传水平调控基因表达，如piRNA、Xist、HOTAIR和eRNA。这一领域仍非常新，有许多未知的东西。

Jun Song（加州大学旧金山分校）：

研究非编码RNA的功能仍然是一个重大挑战。您可以在knockdown一个特定的非编码RNA之前和之后开展RNA-seq。通过比较两个数据集的整体表达模式，了解非编码RNA的直接和间接影响。同理，您也可以开展ChIP-seq，来检测染色体如何被非编码RNA所调控。不过，生物学系统充满了反馈环及互相联系，因此，这些高通量方法将检测到许多二级影响。

Kevin White（芝加哥大学）：

准确测定RNA对基因调控影响的唯一方法是通过详细的生物化学和分子遗传学实验。然而，异位表达microRNA或产生microRNA基因的突变体，接着开展表达谱分析，也是产生候选目标的有力方法。这种方法可进一步细化为，结合计算机预测方法或生物化学方法（如RIP-seq），以鉴定mRNA转录本中的目标位点。