东曹鼎力支持第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班

　　2012年5月5日-6日，由中国生物工程杂志社主办的第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班在北邮科技大厦如期举办。来自科研院所、高校、仪器公司近百名代表与会。作为会议长期赞助商——东曹生物科技有限公司参加了会议，产品经理郝佳越先生还为大家重点介绍了用于蛋白质异构体的HPLC分析的TSK-GEL色谱柱应用。

会议现场

郝佳越先生

　　郝经理首先向大家介绍了公司的相关情况。东曹公司（TOSOH CORPORATION）始建于1935年，本部位于日本东京。东曹（上海）生物科技有限公司负责东曹株式会社生命科学事业部相关产品的销售及提供关联的技术服务，主要包括TSKgel色谱柱，Toyopearl填料，GPC仪器，IC仪器及各类医疗诊断产品。

　　TSK-GEL色谱柱的应用

　　蛋白质具有不均一性，随着抗体药物、重组蛋白等被广泛应用于治疗，蛋白质差异性的品质管理工作变得极其重要，通过分析研究，从而避免聚合物、变性物质等可能导致的过敏性休克或免疫反应。除蛋白质外，DNA、RNA、多肽类药物的研发也同样需要进行此类分析工作。

　　常用的HPLC分析模式 ，有三种：离子交换色谱法 (IEC)、尺寸排阻色谱法 (SEC)、疏水相互作用色谱法 (HIC)。接下来，郝经理通过不同的案例讲解了三种模式下的TSK-GEL色谱柱应用研究情况。

　　1、离子交换色谱法 (IEC)

　　TSKgel CM-STAT用于抗体药物分析实例，如图：

　　样品：

　　A； humanized, IgG1

　　B； humanized, IgG1

　　C； chimera, IgG1

　　D； chimera, IgG1

　　E； chimera, IgG1

　　TSKgel CM-STAT用于核糖核酸酶A脱酰胺化的过程跟踪，下图：

　　核糖核酸酶A在1%的碳酸铵缓冲液(pH8.2)中溶解配制成5g/L浓度的溶液，然后在37度下孵化0-192个小时。孵化完成后，使用20mmol/L的MES(pH6.0)稀释至0.25g/L的浓度并进行HPLC分析。核糖核酸酶A及其两种异构体被完全分离。根据孵化时间与核糖核酸酶A峰面积作图，并推断出在1%的碳酸铵缓冲溶液(pH8.2)条件下，核糖核酸酶A的半衰期大约为180个小时。

　　2、尺寸排阻色谱法(SEC)

　　TSKgel G3000SWXL和TSKgel G4000SWXL分别用于免疫球蛋白的分离分析，下图：

　　样品：

　　1. Human IgM (from myeloma, M.W.:970kDa)

　　2. Human IgA (colostrum,,M.W.:390kDa)

　　3. Human IgG (M.W.:150kDa)

　　4. Transferrin (M.W.:80kDa)

　　5. Human serum albumin (M.W.:66kDa)

　　TSKgel SuperSW3000 用于抗体二聚体的分析，下图：

　　样品：人单克隆抗体(4.6g/L, IgG1)

　　TSKgel G3000SWXL用于木瓜蛋白酶酶解抗体的过程跟踪，下图：

　　样品浓度: 0.19g/L

　　样品浓度：0.24g/L

　　TSKgel G3000SWXL用于PEG化蛋白的分析，下图：

　　TSKgel G3000SWXL用于半抗原结合蛋白的分析，下图：

　　样品浓度:：DNP-ALP；0.67g/L, anti DNP Fab；1g/L

　　3、疏水相互作用色谱法(HIC)

　　TSKgel Butyl-NPR用于抗体药物(木瓜蛋白酶酶解产物)的分析，下图：

脱酰胺化

蛋氨酸氧化

　　TSK-GEL品牌的离子交换色谱柱以及疏水相互作用色谱柱中的固定相，采用了非多孔性、小粒径的填料，具有极高的分辨率，可以检测出因为脱酰胺或氧化等过程中产生的1个氨基酸残基的微小差异。其中尺寸排阻色谱法适合于检测、分析如多聚体或PEG化蛋白等分子尺寸有较大差异的物质。

　　蛋白质分析用大孔径C4色谱柱介绍

　　能够实现蛋白质高分辨率、高回收率分析的反相色谱柱是TSKgel Protein C4-300产品研发理念。它采用了3µm粒径的硅胶,具有更高的理论塔板数，其中孔径为30nm，非常适合于蛋白质分离的孔径尺寸；此外优化了固定相配体的烷基链长度以及表面密度，从而抑制了蛋白质的吸附满足高回收率要求。

　　其规格如下：

　　•基质：硅胶

　　•平均粒径：3 µm

　　•孔径：30 nm

　　•比表面积：100 m2/g

　　•表面官能团：C4（丁基）

　　•封端：有（三甲基硅烷）

　　•碳含量：3%

　　•色谱柱尺寸：

　　4.6 mmI.D. ×5 cm, 10 cm, 15 cm

　　 2.0 mmI.D. ×5 cm, 10 cm, 15 cm

　　•保护柱：

　　3.2 mmI.D. ×1.5 cm

　　2.0 mmI.D. ×1 cm

　　“TSKgel Protein C4-300”是一款适合于蛋白分析的反相色谱柱。 通过实验对比证明，使用短柱可以在高流速下实现快速分析；测定时温度越高，分辨率也越高。作为蛋白分析中使用的离子对试剂，0.05%的TFA或5mmol/L的高氯酸对于该柱是合适的。