中国农大权威期刊发表CRISPR研究

　　通过CRISPR/Cas9基因组编辑系统的组成型过量表达而产生的拟南芥突变体，通常在T1代是嵌合体。七月二十一日，来自中国农业大学的研究人员在国际生物学权威期刊《Genome Biology》发表的一项研究中，利用卵细胞特异性的启动子，来驱动Cas9的表达，并以很高的效率获得了多个靶基因的非嵌合性T1突变体。

　　本文通讯作者是中国农业大学植物生理学与生物化学国家重点实验室的陈其军博士，其2002年在中国农业大学获博士学位，2004年9月起在中国农业 大学生物学院从事教学及科研工作，主要研究方向为：植物非生物逆境胁迫反应重要基因挖掘及功能鉴定；高效多基因转化技术平台的建立及其在抗逆基因工程中的 应用研究；Ta-siRNAs的生物合成调控及在抗逆基因挖掘中的应用研究。

　　大量拟南芥序列索引的T-DNA插入突变体，对于直接研究基因功能，发挥了关键的作用。然而，有两大障碍限制了这些全基因组表型筛选的应用。首先， 大部分株系是半合子的，因此需要一个额外的步骤来确定纯合植株，用于表型分析。第二，12%的基因没有T-DNA插入突变体可用，8%的基因只由一个单一 的等位基因代表。此外，剖析具有冗余功能的基因家族成员所扮演的角色，以及分析遗传途径中的上位联系性，经常需要携带多个基因突变的植物。

　　利用T-DNA插入诱变产生多基因突变的一个障碍是，这种方法需要费时费力的单突变体植株遗传杂交。序列特异性核酸酶的进展，包括大范围核酸酶、锌 指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs），和最近的CRISPR/cas9系统，为开发快速、划算的方法来产生新的突变植物群 体和多基因突变植株，铺平了道路。

　　CRISPR/cas9系统使用一种单向导RNA（sgRNA）提供序列特异性，并依赖sgRNA/Cas9复合物的核酸内切酶活性，在基因组特定 位点产生双链断裂；这些双链断裂可导致宿主细胞中DNA修复系统的激活，通常是通过非同源末端连接途径。由于修复途径是容易出错的，因此在修复过程中将会 引入小的缺失或插入，从而产生突变。这种高效、易于使用的系统，可以用来产生多路复用的基因组修饰，并取代ZFNs和TALENs，成为标准的基因组编辑 技术。

　　在脊椎动物中，将体外转录的Cas9 mRNA和sgRNA共注射到单细胞胚胎中，可高效地产生多基因的双等位基因突变动物；多基因突变也可以有效地传递给下一代。然而，在植物中，细胞壁的存在使得RNA注射方法不切实际。制备可表达CRISPR/Cas9系统的转基因株系，提供了一种替代方法。

　　用来制备转基因株系的农杆菌介导的技术包括：植物原位转化和胚性愈伤组织转化。植物原位转化最典型的例子是农杆菌介导的拟南芥转化，其卵细胞是T -DNA的靶标。胚性细胞来源的转基因株系（表达CRISPR/Cas9系统），编辑的靶基因在第一代植株中是纯合的，说明在第一次细胞分裂之前，靶基因就 在转化的胚性细胞中被编辑。番茄和玉米中也报道过类似的结果。这些结果对于作物基因组编辑的发展来说，是令人鼓舞的，因为作物转化通常采用胚性愈伤组织细 胞，它们可以被认为类似于单细胞阶段的动物胚胎。

　　拟南芥非常适合于原位转化，CRISPR/Cas9系统理论上应该在单细胞阶段的胚胎中发挥作用。然而，表达CRISPR/Cas9的转基因株系， 在第一代（T1）主要是嵌合体，从而表明拟南芥中CRISPR/Cas9诱导的突变发生在第一个胚胎细胞分裂之后。也许CRISPR/Cas9不能在单细 胞阶段的胚胎中发挥功能，是由于组成型花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV 35S）在卵细胞和单细胞阶段胚胎中的活性较弱。

　　在这项研究中，研究人员使用卵细胞特异性EC1.2基因的启动子，来驱动Cas9在拟南芥中的表达，表明CRISPR/Cas9在卵细胞和单细胞阶 段胚胎中的特异性表达，可有效地使T1代拟南芥产生多个靶基因的纯合子或双等位基因突变体。要识别完全突变的、非嵌合性的株系，通常需要对从25-50个 T1转基因植株中筛选的一些候选株系，进行靶位点的中度测序（通过限制性内切酶分析、T7E1试验或Surveyor检测）。

　　然而，目前这种策略可以缩短所需的时间，在一个世代中产生这样的突变体，从而提供一种更快、更具成本效益的方法，来制备新的拟南芥突变群体和多基因突变 体。根据对启动子和终止子的不同组合进行比较，研究人员还提出了一种方法，来优化卵细胞特异性启动子控制的（EPC）CRISPR/Cas9系统。