中外科学家建立食蟹猴胚胎3D长时程体外培养模型

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2023年5月11日，中国科学院动物研究所/北京干细胞与再生医学研究院和美国宾夕法尼亚大学的研究人员在《细胞》杂志在线发表封面文章。他们建立了一个可支持食蟹猴胚胎体外发育至受精后25天的3D长时程培养体系，并基于该体系探究了灵长类胚胎中晚期原肠运动和早期神经发育过程中的核心事件和谱系特征。

世界上每30秒钟就会有一名缺陷儿出生，出生缺陷是婴儿死亡的首位原因。出生缺陷与早期胚胎发育异常密切相关。因此研究早期胚胎发育过程、探究发育机理，对从根源上提高人民健康水平至关重要。

但人类早期胚胎极难获取，因此科学家们无法直接在体探究人类胚胎发育过程和机理。胚胎体外培养技术是可视化研究胚胎发育过程的有力工具。借助人类胚胎体外培养技术，胚胎期第14天之前的发育事件已被初步揭示。然而，由于科研伦理限制，人类胚胎研究遵循“14天原则”，即人类胚胎体外研究必须在第14天终止。因此体外培养的人类胚胎不能被用于研究胚胎期14天之后发生的原肠运动和早期神经胚发育等事件。

为此科学家一直致力于搭建非人灵长类胚胎体外培养体系。1995年，澳大利亚科学家将绒猴的囊胚体外培养至胚胎期11天；2019年，王红梅团队及国内外同行将食蟹猴胚胎体外培养至胚胎期20天。但要探究灵长类胚胎中晚期原肠运动和早期神经胚发育，还需要进一步延长食蟹猴胚胎的体外发育历程。

在本研究中，研究者首先尝试构建可延长食蟹猴胚胎体外发育时程的培养体系。他们首先比较了2D与3D培养体系，发现2D和3D培养体系都能支持胚胎发育到第20天。在2D体系下，胚胎由于胚外组织发育旺盛而迅速增大，但内部的胚体发育并不好；而在3D体系下，胚胎的胚外组织生长受限，但胚体结构显著发育。为了保证胚体发育，研究者继续优化3D体系，并建立了3D长时程培养体系（prolonged in vitro culture，pIVC；图1），该体系能支持33.7%的食蟹猴胚胎发育到胚胎期25天。

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图1. 能够支持食蟹猴胚胎体外发育至25天的3D长时程培养体系

利用此体系，研究者进一步探究灵长类早期神经胚发育过程。研究者对神经系统发育关键调控因子进行鉴定，发现pIVC胚胎的神经管形态和多种分子表达特征与体内相同发育阶段的胚胎相似（图2）。伴随神经外胚层的发育，pIVC胚胎的表皮和神经板边缘的发育同步进行。更重要的是，pIVC胚胎可重现神经管沿背腹轴区域化发育的模式，并分化出早期运动神经元祖细胞（图3）。

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图2. pIVC胚胎神经外胚层和神经嵴的特化

此外，研究者还检测了pIVC胚胎中原始生殖细胞和中、内胚层的发育特征。结果提示与相同发育阶段的体内正常胚胎相比，pIVC胚胎的分子表达特征与正常胚胎相似，表明pIVC胚胎可重现原肠运动中晚期阶段中胚层和内胚层的发育。

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图3. pIVC胚胎神经管细胞的特化

最后研究者进一步利用单细胞多组学测序技术，对9个pIVC胚胎的单细胞的转录组、DNA甲基化和染色质可及性进行测序和分析。结果提示，与本团队2022年在《自然》杂志报道的相同发育阶段的食蟹猴胚胎单细胞转录组数据库相比，pIVC胚胎可重现体内正常胚胎的转录组特征，并且各种细胞类型的基因均发生了甲基化，胚胎组织的DNA甲基化水平高于胚外组织，与已报道的小鼠和人类胚胎特征相似。

本研究在已有体内研究的基础上进一步填补了灵长类胚胎中晚期原肠运动至早期器官发育阶段的领域空白，为灵长类胚胎体外培养和基于干细胞构建的“类胚胎”的体外培养提供了参考体系，为深入了解人类早期胚胎发育机制，以及早期胚胎发育异常相关疾病的病理研究提供了技术平台。

中国科学院动物研究所副研究员翟晶磊、博士研究生徐艳红、助理研究员万海峰、博士研究生燕蕊、博士研究生郭敬以及美国宾夕法尼亚大学博士后Robin Skory为本文共同第一作者。中国科学院动物研究所/北京干细胞与再生医学研究院王红梅研究员、郭帆研究员、李伟研究员和美国宾夕法尼亚大学Nicolas Plachta教授为本文共同通讯作者。