中科院Cell发表CRISPRCas研究新成果

　　来自中科院生物物理研究所的研究人员，在新研究中揭示出了CRISPR-Cas系统依赖于PAM获取间隔序列(spacer)的结构基础及机制。这项重要的研究工作在线发布于10月15日的《细胞》（Cell）杂志上。

　　论文的通讯作者是中科院生物物理研究所的王艳丽（Yanli Wang）研究员，其主要研究方向为RNA干扰相关蛋白的结构与功能研究。王艳丽研究组的王久宇（Jiuyu Wang）和李佳智（Jiazhi Li）为本文的共同第一作者。

　　CRISPR和Cas蛋白一起形成了一种微生物适应性免疫系统，保护细菌对抗入侵噬菌体和质粒。CRISPR是由一些长度为30-60个核苷酸的 “重复序列”（ repeat）组件构成,这些重复序列被长度变化为30-60个核苷酸的“间隔序列”(spacer)组件所间隔，间隔序列获取自外源DNA。定位在第一 个重复序列上游的富含A-T的前导序列(leader sequence)对于获取间隔序列至关重要，并促进了CRISPR 序列转录（延伸阅读：Science发表CRISPR基因组编辑重要成果）。

　　CRISPR-Cas系统抵御来自噬菌体或质粒的入侵核酸分为三个步骤。首先，在间隔序列获取阶段，会从入侵DNA处获得一个新间隔序列，整合到 CRISPR位点中。第二步，这一CRISPR位点会被转录加工为短成熟CRISPR RNA (crRNA)，crRNA随后结合Cas形成一种蛋白质-RNA复合物。最终，蛋白质 -crRNA复合物会识别与降解与crRNA互补的入侵核酸。尽管当前已充分确定了表达及干扰阶段的分子和功能机制，对于间隔序列的获取阶段仍有待详细的分 析。

　　Cas1和Cas2是唯一普遍保守存在于所有CRISPR-Cas系统中的两个Cas蛋白。以往体外分析的结果表明Cas1是一种金属依赖性的酶， 能够以一种序列非依赖性方式切割单链(ss) DNA、双链(ds) DNA、十字形DNA及分支DNA。同样，Cas2曾被确定为是一种金属依赖性核糖核酸内切酶可切割ssRNA或dsDNA。但近期的一项研究证实 Cas2的“活性位点”并非获取间隔序列的必要条件，表明Cas2可能发挥了其他未知的功能。

　　大肠杆菌Cas1和Cas2过表达可通过在第一个重复序列后插入33 nt外源DNA来诱导获得新的间隔序列，表明Cas1和Cas2是获得新间隔序列的必要及充分条件。以往的研究证实，Cas1和Cas2形成了一种稳定的 复合物，发挥整合酶作用将新间隔序列插入到CRISPR位点中。在大肠杆菌中，这一整合过程涉及交错切割第一个CRISPR重复序列，新的间隔序列被整合 至前导序列附近。

　　为了了解获取间隔序列的机制，在这篇Cell新文章中研究人员确定了大肠杆菌Cas1-Cas2结合双叉DNA复合物的晶体结构。他们证实 Cas1-Cas2捕获的前间隔序列DNA采纳了一种双叉形式，前间隔序列的3′overhang对于新间隔序列获取至关重要。PAM互补序列(5′ -CTT-3′)定位在这一3′overhang内，Cas1a以一种序列特异性方式被识别并切割5′-CTT-3，分别在两端的3’ overhang切割出5nt的长度，产生了一段33nt长度的DNA片段，通过一种剪切粘贴机制插入到CRISPR序列中。一旦前间隔序列结 合，Cas1-Cas2会发生显著的构象改变，生成一个有利于正确前间隔序列识别的平面。

　　新研究揭示出了有关PAM依赖性间隔序列获取的重要结构机制。