中间丝的分离方法实验

实验材料 细胞

试剂、试剂盒 蛋白酶抑制剂裂解缓冲液解聚缓冲液组装缓冲液

仪器、耗材 匀浆器

实验步骤

1. 从培养皿或瓶中吸去培养基并用 5 ml 含蛋白酶抑制剂的冰冷的 PBS 洗细胞。

2. 每 75cm2 瓶或培养皿用 1 ml 冰冷的裂解缓冲液 5 分钟裂解细胞。

裂解缓冲液：

在 PBS 中加入：

1% Triton -X-100

0.6 mol/L KCl

10 mmol/L MgSO4

3. 每 ml 细胞裂解液加 0.5 mg DNA 酶Ⅰ，4℃ 冰浴 5 分钟或冰浴至细胞裂解物的黏滞度明显降低。

4. 4℃ 下以 1500 g 离心裂解物 10 分钟。

5. 用含有蛋白酶抑制剂并且含 5 mmol/L EDTA 的 PBS 洗沉淀物两次。

6. 沉淀物在解聚缓冲液中混匀（蛋白终浓度应该大约为 1 mg/ml）并在 20℃ 搅拌 30 分钟。

解聚缓冲液：

10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0

8 mol/L 尿素

0.2% β-巯基乙醇

5 μmol/L EDTA

7. 匀浆了的沉淀物在 20℃ 以 200000 g 离心 30 分钟。

8. 用适当的组装缓冲液透析上清（蛋白浓度应该大概为 0.5 mg/ml ) 来促进中间丝的组装。Ⅰ型和Ⅱ型或者Ⅲ型中间丝至少在 20℃ 透析 3 小时。

用于Ⅰ型和Ⅱ型中间丝蛋白（角蛋白）的组装缓冲液：

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4

0.2% β-巯基乙醇 

用于Ⅲ型中间丝蛋白的组装缓冲液：

PBS

9. 透析了的制品在 4℃ 以 100000 g 离心 30 分钟，回收聚合了的中间丝沉淀物。

10. 重复 2 或 3 次步骤 6~9 以减少除中间丝蛋白或中间丝相关蛋白以外蛋白质的量。