临床化学定量测定方法的可报告区间

　　自2005年中国合格评定国家认可委员会（CNAS）开始进行医学实验室认可工作以来，参与并通过医学实验室认可逐渐成为医学实验室检测能力的表征。越来越多的临床实验室开始关注认可要求并着手开展相关工作，对检验程序进行验证与确认则是其中的重要环节。CNAS-CL02-2012规定“在常规应用前，应由实验室对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证”，“实验室应对非标准方法、实验室设计或制定的方法、超出预期使用范围的标准方法及修改过的确认方法进行方法确认”[1]，在CNAS-CL02-A003:2018中指出“检验方法和程序的分析性能验证内容至少应包括正确度、精密度和可报告范围”，“如果使用内部程序，如自建检测系统，应有程序评估并确认正确度、精密度、可报告范围、生物参考区间等分析性能符合预期用途”[2]。可见无论是对检验程序进行验证还是确认，正确度、精密度与可报告范围均是必不可少的性能特征。有关正确度与精密度的确认与验证已有很多相关文献，本文将主要阐述对于可报告范围的确认与验证。

　　可报告范围（reportable range）近年来常被称为可报告区间（reportable interval）。在ISO/IEC Guide 99:2007中开篇即对区间（interval）与范围（range）的不同含义进行了说明，简要理解为区间是一个实数集合，而范围则是区间两端实数的差值[3]。从这一说明来看，上文中的可报告范围及随后将提及的测量范围 、线性范围等均为实数集合，因此采用“区间”的表述更为严谨。

　　ISO/IEC Guide 99:2007中词条4.7给出了测量区间的定义，“在规定条件下，可由给定测量仪器或测量系统以规定的仪器不确定度测量的相同类量的量值的集合”[3]。ISO18113-1:2009中词条3.46对于测量区间也给出了相同的定义，同时在该定义的注1中将可报告区间解释为“体外诊断医疗器械性能特征已被确认（validated）的测量区间被称为可报告区间”[4]。美国临床实验室改进法案规则(CLIA’88) 493.2中给出了另一个应用较广的可报告区间定义，“实验室可建立（establish）或验证（verify）仪器或测量系统响应准确性的测量结果区间”[5]。对测量系统性能特征的确认与验证本质上都是为了给测量结果的准确性提供证据，因此上述关于可报告区间的定义其内涵是相同的。

　　测量区间的定义着重于所属区间内的任一量值由符合目标不确定度要求的测量系统给出，可报告区间定义的重点在于所属区间内的任一量值由符合准确度要求的测量系统给出，除非目标不确定度与准确度要求不同，否则在多数情况下，测量区间与可报告区间应是相同的。

　　那么，可报告区间的下限与上限该如何确定呢？

　　可报告区间下限的确定与测量系统的检出能力有关。测量系统的检出能力通过三个性能参数表征，分别为空白限（limit of blank, LoB）、检出限（limit of detection, LoD）与定量限（limit of quantitation, LoQ）。LoB是在声称概率下，测量空白样本时观察到的最高测量结果[6]。LoD则是在声称概率下，测量系统能检出的最低分析物浓度，此分析物成分不存在的误判概率为β，存在的误判概率为α[3]。LoQ是满足声明的精密度和正确度，在声明的实验条件下能够可靠定量的分析物的最低浓度，也称为定量低限（lower limit of determination/quantitation, LLoQ）[6]。虽然LoB与LoD的评估均基于测量系统的变异和Ⅰ类及Ⅱ类错误概率的设置，但LoB是分析物并不存在时测量系统的最大响应，LoD则是测量系统对样本中微量分析物浓度的真实响应，虽然不能做到可靠定量，但指示了分析物的实际存在，当采用CLSI EP17中的方案评估检出能力时，LoB的数值要小于LoD。LoQ表明测量系统能可靠定量的最低分析物浓度，是仅适用于定量测量程序的性能特征，其估计值与设定的准确度目标相关。可报告区间/测量区间的下限即为LoQ。

　　可报告区间上限的确定与线性区间相关。定量检测方法的线性指测量系统的测量结果与样本中分析物浓度成正比的能力。线性区间则是测量系统的非线性误差在预先设定的误差界值之内的量值区间[7]。美国临床病理学会（College of American Pathologists，CAP）提出了分析测量范围（Analytic Measurement Range, AMR）的概念，指样本未经稀释、浓缩或其他不属于常规操作过程的预处理时，由测量程序直接测量的样本浓度范围，在AMR范围内，测量系统的测量结果与样本浓度应为线性关系[8]。CLSI EP34规范了此概念的表述方式，称为分析测量区间（Analytic Measurement Interval, AMI），在明确样本应未经稀释、浓缩或其他不属于常规操作过程的预处理的同时也强调了AMI是测量系统以符合临床与实验室的准确度需求测量的样本浓度区间[9]。AMI涵盖区间的线性、精密度与偏倚的可接受性均已经过验证。结合线性区间的评估方案与AMI的定义，可认为线性区间与AMI代表的是同一个量值区间。线性区间的上限即为方法的定量高限（upper limit of quantitation, ULoQ）。为满足临床需求，有时要对分析物浓度超出AMI的样本进行准确定量，此时建立一个有效的样本稀释程序是非常必要的。通过这一样本稀释程序可确定分析物浓度超出ULoQ时最适合的稀释液及稀释因子，同时也得到了方法的扩展测量区间（extended measuring interval，EMI）。CLSI EP34中对EMI的定义为样本按照预设操作过程经过稀释处理后，由测量系统以符合适当准确度需求测量的样本浓度区间[9]。此区间的上限为ULoQ与稀释因子的乘积。稀释程序的建立与验证保证了EMI符合适当的准确度需求。EMI的上限即为可报告区间/测量区间的上限。

　　至此对可报告区间已经了解：1.区间下限为LoQ，2.区间上限为EMI上限，3.可报告区间内包含两种区间，分别为线性区间与EMI。可报告区间的验证可分解为对多个性能特征参数的验证。从区间的下限到上限分别为：LoQ、线性区间/AMI、EMI。这些参数的验证均有相应的CLSI标准或国内卫生行业标准，CNAS针对医学实验室认可也编制了相应的性能验证指南。下表对相关文件与标准进行了汇总。

　　除了表中所列文献外，卫生行业标准WS/T 420-2013中部分内容也涉及到了商品定量试剂盒的线性区间验证[10]。此标准中有关线性区间验证的实验设计、样本制备与测定等具体操作步骤与CLSI EP06-A和WS/T408-2012没有明显差别，但在数据处理方式上采用了不同的统计学假设。CLSI EP06-A与WS/T408-2012采用了多项式法进行线性评价，首先假定数据组是非线性的，然后通过对多项式中非线性系数的统计学检验以证实方法的统计学线性，并对非统计学线性的情况进行临床线性的评估，同时也考察测量精密度对线性评估有效性的影响[7,11]。WS/T420-2013则假定数据组应该为线性，据此对数据进行线性回归处理，并通过决定系数（r^2>0.995）和实测值与拟合值间的差异（不大于厂家声称值）对结果进行判读[10]。WS/T420-2013中的方法大大减少了数据处理难度，用于线性区间验证时简单省时，但这种方法在一定程度上降低了评估结果的可靠性与严谨性，正如在其适用范围内所述，此标准不适用于厂家或实验室对测量系统的线性区间进行确认。

　　实验室在进行线性区间验证时还经常遇到的一个疑问是，线性区间的下限能否为零？这一问题的解答可从文中提及的5种与低浓度水平检测能力相关的性能参数着手，这些参数分别为可报告区间的下限、线性区间的下限、LoB、LoD与LoQ。线性区间的评估方案中需要预设非线性误差，非线性误差也是一种准确度指标，合理设置的非线性误差应当与目标不确定度是等效的，此时线性区间的下限也是LoQ，即可报告区间的下限。大多数情况下，LoB应小于LoD，而根据可接受的准确度目标，LoQ可等于或高于LoD。因为LoB不可能为零，故在进行线性评估时，线性区间的下限是不能为零的。

　　可报告区间的验证并非一个孤立的过程，精密度、正确度、检出能力等诸多测量系统性能特征参数的验证组成一个有序的整体，在进行可报告区间的验证前，至少要先进行精密度与正确度的验证。在选用何种验证方案时，需要考虑各方案的适用范围及有无特殊要求。如在进行医学实验室认可时，最好采用相关指南中给出的验证方案。

　　2018年出版的CLSI EP34中提出可报告区间包括AMI与EMI，并将可报告区间的下限由LoQ下延至LoD[9]。而如上文所述，可报告区间与测量区间是一致的，在ISO/IEC Guide 99:2007测量区间的定义中明确指出不要将测量区间下限与LoD相混[3]，因为LoD与LoQ的评估基于不同理论，位于LoD与LoQ之间的结果虽也能以数值表示，但有较大的不确定度，不能认为LoD与LoQ之间的结果是可靠定量的。因未见到CLSI EP34原文，对于文中这一说法的原因未知。但无论是何原因，这一观点可能使可报告区间的定义发生改变。此时对可报告区间的验证还应包括对LoD的验证。