乳腺上皮细胞培养实验

RPMI 1640                                                                  胎牛血清                                                                  人血清                                                                  胰岛素                                                                  氢化可的松                                                                  霍乱毒素                                                                  胰蛋白酶液                                                          

培养瓶                                                                   离心管                                                          

材料

无菌

1. 生长培养液：RPMI 1640

2. 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS)

3. 人血清（human serum: 血库过期的血清，澳大利亚抗原阴性）

4. 储存备用的液体：
(a) 1 mg/ml 胰岛素（Sigma)：用 6 mmol/L 盐酸配制；
(b ) 0.5 mg/ml 氢化可的松：用生理盐水配制；
(c) 50ug/ml 霍乱毒素: 用生理盐水配制。

注意事项

血清和储存备用的胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素、胰酶和胰蛋白酶应在-20°C 条件下保存。

5. TEGPED： 胰蛋白酶液，含有下列成分
(a) 13 mmol/L EGTA (ethylene glycol-bis-(β-aminoethylether) -N，N，N‘，N'-tetraacetic acid，Sigma）：10 ml，用 D-PBSA 配制；
(b) 7 mmol/L EDTA（diaminoethane tetraacetic acid，Sigma): 4 ml, 用 D-PBSA 配制；
(c) 0.2% 胰蛋白酶（Difco,B-I) Bioscience): 4 ml, 用 HBSS 配制；
(d) 1% 胰蛋白酶（Difco ,B-D Bioscience): 2 ml，用 HBSS 配制。

6. 生长培养液：RPMI 1640, 添加 15% FBS、10% 人血清、50ng/ml 霍乱毒素

7. 0.5ug/ml 氧化可的松和 1ug/ml 胰岛素 

8. 50 mm Nunc 塑料培养皿或 25 cm² 培养瓶 

9. 普通容器或 20～50 ml 离心管

操作步骤

最好在医院病房于产后 2～7d 收集乳汁。用无菌水擦洗乳房，然后用手将乳汁挤入无菌容器。一般每个病人收集 5～20 ml 乳汁。将收集的乳汁混合后，用 RPMI 1640 稀释（1 : 1 ) , 以利于离心。

原代培养 

1. 将稀释的乳汁离心（600～1000 g，20 min) 后，轻轻吸去上清。为了避免影响沉淀细胞，应留有少量液体。

2. 用含有 5% FCS 的 RPMI 1640 清洗细胞 2～4 次，直至上清不浑浊。

3. 用生长培养液混悬细胞，将 5ul 细胞悬液加入 50 mm 培养皿（Nunc)。然后，加人 6 ml 生长培养液，在 37°C 和 5 % CO₂ 条件下培养细胞。

4.3～5d 后换培养液，以后每周换 2 次。6～8d 出现克隆，克隆细胞生长挤掉巨噬细胞。开始时，巨噬细胞起着饲养细胞的作用。

传代培养

5. 在 37℃ 条件下用 TEGPED (每个 50 mm 培养皿 1.5 ml) 孵育细胞 5～15 min。孵育时间根据细胞已培养时间而定。然后，混悬细胞。

6. 离心（100 g，5 min ) 后，用 6 ml 培养液混悬细胞。

7. 将细胞悬液分放入 50 mm 培养皿和 25 cm² 培养瓶，每 3 个培养皿或每个培养瓶 2 ml。

8. 加入 4 ml 新鲜培养液，将细胞悬液稀释 3 倍。