乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK细胞活性实验

乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一。在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中，释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶I (NADH2），后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm或570nm波长处有一高吸收峰，利用读取的OD值，经过计算即可得NK细胞活性

1．靶细胞制备　

取培养24～48h的靶细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105／ml，备用。

2．效应细胞的制备　

常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×l07／ml。

3．效-靶细胞作用　

将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T＝100∶1)加入40孔细胞培养板的孔中，每份标本设3复孔，同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组(0.1ml靶细胞＋0.1ml 1％NP-40液)，低速离心1000r／min，2min后，置37℃、5％CO2温箱中孵育2h。

4．酶促反应　

取出培养物，吸取各孔上清0.1ml加于另一培养板孔中，置37℃预温10min，每孔加入新鲜配制的LDH底物溶液0.1ml，室温避光反应10～15min，每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μl，以终止酶促反应。

5．结果计算　

用酶联检测仪在570nm波长下读取各孔OD值，并计算NK细胞活性。

NK细胞活性(％)=■×100％