产1,3丙二醇新型基因工程菌的构建

摘 要 以甘油为底物转化生产1,3-丙二醇的生物合成途径中，往往由于还原力NADH的不足，限制了1,3-丙二醇的合成，引起中间代谢产物3-羟基丙醛累积，进而抑制甘油脱水酶的活性，阻碍菌体的生长，严重影响1,3-丙二醇的合成途径. 为了解决合成途径中还原力不足这一主要矛盾，本文以大肠杆菌和克雷伯氏菌染色体DNA为模板克隆得到yqhD和dhaB、dhaT基因，构建双启动子表达载体pEtac-dhaB-tac-yqhD及表达载体pUC-tac-dhaT，成功共转入E. coli JM109，得到可利用两种辅酶（NADH、NADPH）将甘油转化为1,3-丙二醇且传代稳定的重组大肠杆菌双质粒系统，发酵结果表明，1,3-丙二醇产量提高了28.6%. 图6 表1 参17

    1,3-丙二醇（1,3-PD）是目前国际上公认的六大石化新产品之一，其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体[1]. 1,3-PD的生产方法有化学合成法和微生物转化法[2~5]. 微生物转化法以其利用可再生资源、清洁生产、对环境友好、有利于可持续发展等优点逐渐成为国内外研究的热点. 目前利用自然筛选的微生物直接进行1,3-PD的发酵法生产存在产物浓度低、副产物复杂和甘油转化率低等问题. 因此，利用基因工程技术构建高产菌株备受国内外研究者的青睐.通常，甘油厌氧转化为1,3-PD属于还原途径，其中辅酶NADH作为还原当量起着关键的作用，辅酶NADH供应量不仅直接影响到1,3-PD的产量，而且NADH不足会导致3-羟基丙醛累积，对细胞生长有毒害作用. 因此，适当提高胞内NADH供应量及NADH/NAD比例，有望提高1,3-PD合成浓度[6]. 辅酶NADH价格昂贵，在工业生产中不断添加NADH显然是不可行的[7]. 因此需要用新的思路和方法来解决这一矛盾.
    最近研究发现，来自大肠杆菌的非特异性氧化还原酶是1,3-丙二醇氧化还原酶的同工酶（编码基因yqhD，以NADPH为辅酶），比1,3-丙二醇氧化还原酶催化底物3-羟基丙醛的效率明显提高[8]. 本研究室已成功地克隆和表达1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶yqhD基因[9]. 在此基础上，本研究以大肠杆菌和克雷伯氏菌染色体DNA为模板克隆得到yqhD和dhaB、dhaT基因，利用基因工程手段分别构建重组载体pEtac-dhaB-tac- yqhD和pUC-tac-dhaT，并在大肠杆菌JM109中共表达，重组大肠杆菌1,3-PD产量提高了28.6%. 研究结果为提高1,3-丙二醇产量提供了一种新途径.