亲和柱层析法提纯mRNA

实验概要

该方法利用mRNA上的寡聚A可与较联寡聚T的纤维素柱在高盐下以碱基配对形式发生亲和吸附，而在低盐下，碱基配对能力破坏，吸附解除，而其他成分的RNA则不具该特性，因此在高盐下当RNA抽提样品流经该柱时，mRNA被挂在柱上，而其他RNA则随高盐溶液流出；当用低盐洗脱液洗柱时，mRNA随洗脱液流出。再用有机溶剂沉淀则可得纯化mRNA。

主要试剂

柱材Oliga(dT）－纤维素

上样液：20mM  Tris-HCL(pH 7.6)

          0.5M   NaCL

          1mM   EDTA (pH 8.0)

          0.1%   十二烷基肌氨酸钠（SLS）

洗脱液：10mM Tris-HCL(pH 7.6)

          1mM EDTA  (pH 8.0)

          0.05% SDS

主要设备

层析系统，水浴，离心机，取液器，分光光度计

实验步骤

1. DEPC处理层析柱。

2. 0.1M NaOH处理Oliga(dT）－纤维素。

3. 用1×上样液洗柱至pH< 8.0。

4. 无菌水溶解RNA，65℃温浴5分钟后，迅速冷却至室温，加等体积2×上样液，上样，分部收集。

5. 1倍体积1×上样液洗柱，分部收集。

6. OD260沉淀收集液，确定收集液的该值是否接近0，如该值仍很大，则上样液继续洗柱，直至该值接近0。

7. 2－3倍柱床体积的洗脱液，洗柱，分部收集。

8. 测定各收集管的OD260，将有吸光值的各管合并。

9. 在洗脱液中加入0.1体积的NaAC，1体积的异丙醇，－20℃沉淀过夜，12000g 离心10min，75%乙醇洗沉淀，真空干燥。

10. 提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260，280nm比色，要求A：OD260％/ OD280％不小于2.0及40μg所提样品在OD260％的值为1 .

11. 提取mRNA质量的电泳检测，在1%的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色，1.5-2Kb间着色较强。