人单个核细胞分离液使用注意细节

人单个核细胞分离液1.077是一种用于分离人外周血单个核细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，1.090g/mL 左右，淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075~1.090g/mL，血小板为1.030~1.035g/mL。为此利用一种密度介于 1.075～1.092 之间而近于等渗的。

人单个核细胞分离液1.077使用说明：

1、取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝均可），用等体积的全血及组织稀释液或者PBS稀释全血。

2、在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前会出现红细胞成团下沉属正常现象。）

3、室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，分离条件需摸索，离心转速大不超过1200g）。

4、离心后将出现明显的分层：上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。

5、小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心10min。

6、弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。

7、重复步骤6

8、弃上清，细胞重悬备用。