人和哺乳动物原代细胞的蛋白质抽提步骤

一、培养的贴壁原代细胞的蛋白质抽提基本步骤
1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。
2、预冷的1×PBS（pH 7.4）清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。
3、蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液\5μlPMSF和5μl磷酸酶混合液等等）。
4、细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂），轻轻摇动5分钟。
5、用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。

6、裂解液于预冷的离心机中14，000×g离心15分钟。弃去沉淀，上清液蛋白质抽提物立刻转移入新的离心管中保存待用（-80oC或液氮中）。

二、培养的悬浮动物细胞的蛋白质抽提步骤
1、2500×g离心10分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液
2、预冷的1×PBS（pH 7.4）悬浮沉淀细胞，2500×g离心10分钟沉淀细胞，去上清。
3、蛋白质抽提剂（1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液\5μlPMSF和5μl磷酸酶混合液等等）。
4、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂），轻轻摇动5分钟。
5、细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14，000×g离心15分钟。弃去沉淀，上清液蛋白质抽提物立刻转移入新的离心管中保存待用（-80oC或液氮中）。

三、哺乳动物组织的蛋白质抽提步骤
1、组织称重，切小块放入管中。
3、蛋白质抽提剂（1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液\5μlPMSF和5μl磷酸酶混合液等等）。
3、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。
4、用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14，000×g离心15分钟。弃去沉淀，上清液蛋白质抽提物立刻转移入新的离心管中保存待用（-80oC或液氮中）。