人末梢血微量全血培养染色体显示法

实验概要

        人末梢血微量全血培养染色体显示法

实验步骤

1．培养液准备：取15ml培养瓶数个，每瓶内分别充入5ml培养液（pH 7.2），内含：1640培养液（含10％～15％小牛血清），PHA 0.1ml，青霉素100单位和链霉素100微克/毫升 培养液

2．抽血针管准备：取2～5ml针管一支，在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器，无菌抽肝素（100 U/ml BBS）少许湿润针管，如动作迅速不用肝素亦可。

3．采血：用棉签75％酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次，缚止血带，静脉取血1～2ml。无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4～0.5ml，如系外出采血，安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作，但动作要迅速，以减少污染；在采血量不多或不应抽血的情况下，亦可在耳垂、手指肚（无名指）用刺血针采血。

4．培养和加秋水仙素：37℃温箱中培养到60～72小时之间，此时细胞分裂相最多，向每培养瓶内加秋水仙素，最终浓度0.02～0.08微克/毫升营养液，再培养4～6小时。

5．低渗：1000转/分钟离心10分钟，吸除上清液，加入预温过的0.075M KCl溶液10ml，置温箱中低渗处理15～20分钟。

6．预固定：向悬液中加新鲜1：3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打调匀，此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。

7．固定：离心，同4，吸除上清液，加新鲜固定剂5～10ml；加固定剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之慢慢流入离心管中，然后轻轻吹打均匀，置15～20分钟。

8．重复7，末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5～1ml。

9．制片：用滴片法制片，按如下步骤：彻底洗净载物片，勿留任何油脂，置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片，在载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴2～3滴细胞悬液，滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。

10.染色和封片：一般常用Giemsa染色：取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合，染色10分钟后，水洗、晾干、可直接观察。如标本需要
       保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片后，再过二甲苯，然后封片亦可。