人毛细血管内皮细胞的分离

样品

PBS 两性霉素 庆大霉素

大剪刀 刮刀 烧瓶 钢筛网 离心管 层流柜

1. 准备下列器械并消毒（高压灭菌，或者可能的话一次性使用）：

大剪刀（两把）

刮刀（两或三把）

胰蛋白酶消化的烧瓶（每 30 g 绞碎样品一个）

带接液器的 250-μM 钢筛网

15-ml 和 50-ml 离心管

2. 分离组织样品。所有操作在层流柜中进行。

(1) 从腹整形样品分离

① 解剖样品，去除任何皮肤、筋膜、肌肉等，只保留脂肪组织。称重样品，每 10 g 分装一份。

② 在无菌盘上，用剪刀将样品剪碎。

③ 用 60 ml 注射器（不带针头）吹吸样品，反复3次或至样品充分液化。

④ 取 20 ml 组织放入装有 20 ml PBS 的 50 ml 离心管，混匀，700 r/min 离心 5 分钟吸出含血水相，重复操作，直至样品相对无血。

(2) 从吸脂样品分离

① 置真空包装样品于筛网上，用含 0.5 μg/ml 两性霉素和 200 IU/ml 庆大霉素，200 μg/ml 链霉素的 PBS 反复冲洗。冲洗过程中用刮刀在被冲洗物周围搅动，辅助冲洗。

② 取 20 ml 组织放入装有 20 ml PBS 的 50 ml 离心管，混匀，700  r/min 离心 5 分钟。吸掉含血水相。

3. PBS 溶解 BSA 至终浓度 4.0 mg/ml（PBS/BSA）；过滤除菌。配制胶原酶溶液，PBS/BSA 溶解胶原酶和 DNA 酶，终浓度分别为 4.0 mg/ml 和 0.02 mg/ml，0.2 μM 滤膜过滤除菌。

10 ml 溶液大约可以处理 10 ml 脂肪样品。

4. 用无菌刮刀把步骤2中剪碎的脂肪组织刮到胰蛋白酶消化的烧瓶中，然后加入胶原酶，每毫升组织加 1 ml。

5. 37℃ 80 r/min 旋动保温 30 分钟。

6. 消化的同时，用 PBS 稀释 PBS/BSA（4.0 mg/ml BSA）至 BSA 终浓度 0.2 mg/ml。

7. 消化样品倒入 50 ml 离心管（每管约 20 ml）。

8. 吊筒式医用台式离心机室温 1500 r/min 离心 5 分钟。

9. 液态脂和水相倒入另一 50 ml 离心管。由于细胞沉淀极易被倒掉，最好使用无菌离心管。

10. 细胞重悬于 5 ml PBS（0.2 mg/ml BSA），1500 r/min 离心 5 分钟，倒掉上清。沉淀悬于 1 ml 含 5% FCS 的 PBS（PBS/FCS）中。