人淋巴细胞的培养

人淋巴细胞的培养

1.实验目的

（1）能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。

（2）熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。

（3）熟练掌握细胞传代培养的操作方法。

（4）观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。

（5）掌握死活细胞的鉴别原理及方法。

实验原理：

（1）传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作

（2）清洗与消毒是组织培养实验的*步，是组织培养中工作量zui大，也是zui基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。

（3）灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。

（4）细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子；酶、微量元素和激素；保护作用；提供伸展和贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。 

（5）氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。

（6）悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。悬浮型细胞传代培养的zui大特点是原代细胞不必经过机械分离或消化酶消化处理，传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。因此，细胞在从原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少，损伤程度也较轻，相对而言，传代的成功率较高。但由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大。

（7）细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，zui常用到的方法是染色排除法。由于许多酸性物质不易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来区别死活细胞。

实验设备及材料

（一）仪器：

超净工作台、干燥箱、过滤器、高压灭菌锅、多重蒸馏水器、磁力搅拌器、天平、微量加样器（移液枪）、倒置显微镜、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、显微镜、血球计数板

（二）材料：

微孔滤膜（直径25mm，孔径为0.22um）、细胞培养瓶、玻璃棒、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸 、pH试纸、微孔过滤器（0.22μm）及注射器、各种规格的Tip 、离心管 、细胞培养瓶、滴管、人类淋巴细胞株

（三）试剂：

75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、 HCl、1%酚红 、RPMI 1640干粉、小牛血清、青霉素、链霉素 、饱和NaHCO3 、L-谷氨酰胺 、三蒸水、乙醇、0.4%台盼蓝溶液（生理盐水配制）