人溶菌酶的药理作用及在毕赤酵母表达系统中的表达研究

人溶菌酶是一种重要的非特异性体液免疫因子，对于人体而言是不可或缺的，药理研究表明其具有抗菌消炎、抗病毒和增强免疫力等功能。人溶菌酶在人体内分布虽然广，然而难以获取，因此人溶菌酶的广泛应用只能寄希望于采用DNA重组技术，利用酵母表达或真核表达系统进行大规模生产人溶菌酶。

人溶菌酶是人体本来就存在的一种蛋白质，作为药物使用不会对人体产生任何不良反应和副作用，即使长期使用也不会产生耐药性，一些生物公司提供的蛋白表达服务可以高效表达人溶菌酶。毕赤酵母表达系统是一种能够高效表达重组蛋白的系统，一方面由于毕赤酵母属于真核生物，因此毕赤酵母表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。随着人溶菌酶研究的深入，相信终有一天会开发出具有重要临床价值的药物。

1、人溶菌酶的药理作用

（1）抗菌消炎

众所周知，肽聚糖是革兰氏阳性菌细胞壁的一种重要成分。人溶菌酶可水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺中的B-1,4糖苷键，在渗透压作用下导致革兰氏阳性菌细胞壁破裂，发生溶菌作用。在体内环境下，由于有分泌型免疫球蛋白A、补体参与，人溶菌酶还能水解某些革兰氏阴性菌，如大肠杆菌等。由于真菌细胞壁中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺之间形成的B-1,4糖苷键(几丁质)也是人溶菌酶作用的底物，所以人溶菌酶可以抗含有几丁质细胞壁的真菌感染。人溶菌酶还能与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并增强抗生素和其他药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而有利于修复被炎症损伤的组织。

（2）抗病毒

人溶菌酶是一种碱性蛋白质，在体内近于中性的pH环境下带有大量正电荷，可与带负电荷的病毒蛋白起作用，和DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使侵入体内的病毒失活。

（3）增强免疫力

溶菌酶参与机体内多种免疫反应，在机体正常防御和非特异性免疫中具有重要作用。它可改善和增强巨噬细胞吞噬消化功能，降低细胞抑制剂导致的白细胞减少，结合细菌脂多糖，减轻内毒素作用，以达到增强机体抵抗力的目的。

（4）激活血小板

人溶菌酶能激活血小板，改善组织局部循环障碍，分解脓液，增强局部防卫，从而更好地体现抗菌、消炎、止疼等作用。

2、人溶菌酶在毕赤酵母表达系统的表达研究

(1)将α信号肽和人溶菌酶（hLYZ）基因作为整体进行密码子优化，并将其插入pPICZαA空载体，构建重组表达载体pPICZ-OptαF+hLYZ。通过转化筛选，获得一株稳定性较好的重

在5 L发酵罐中培养K1，细胞密度达到50 g-DCW•L-1开始诱导，甲醇浓度控制于5 g•L-1，最终的总蛋白浓度为1.71 g•L-1，总酶活达到262,152 U•mL-1。

(2)对α信号肽做了进一步的优化处理，新插入39个碱基，构成包含增长的信号肽和人溶菌酶（hLYZ）基因的新序列将其插入pPICZαA空载体，构建得到另一表达载体pPICZ-EhnαF+hLYZ，通过转化筛选获得重组子K4。K4摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为320 mg•L-1，总酶活为16,974 U•mL-1，均优于K1。在5 L发酵罐中采用与K1相同的诱导策略，最终发酵液中的总蛋白浓度可达到2.54 g•L-1，比K1提高48.5%，但总酶活为258,712 U•mL-1，比 K1 略低。

(3)考察了 K4在高细胞密度(～100 g-DCW•L-1)下起始诱导的hLYZ表达性能。进行纯甲醇诱导，并将甲醇浓度控制于5 g•L-1，诱导54 h发酵液中的总蛋白浓度为3.02 g•L-1，但随后发生严重降解，诱导68 h后仅剩2.07 g•L-1。采用甲醇/山梨醇共混流加策略，优先将甲醇浓度控制于5 g•L-1，不控制溶解氧浓度，诱导68 h总蛋白浓度可达到2.88 g•L-1，未出现明显的蛋白降解现象。上述二种诱导策略下最高的总酶活水平分别为324,072 U•mL-1 和 290,438 U•mL-1。

(4)利用Bgl Ⅱ和BamH Ⅰ属于同尾酶的特点，设计多拷贝串联hLYZ基因表达载体，并获得了两拷贝及四拷贝串联hLYZ基因转化重组子K-2-2、K-4-2。摇瓶发酵条件下，K-2-2和K-4-2的最高总蛋白浓度分别为193.0mg•L-1和185.3 mg•L-1，对应的总酶活分别为5,256 U•mL-1和5,424 U•mL-1。5 L发酵罐中，K-2-2低细胞密度(～50 g-DCW•L-1)诱导73 h及高细胞密度(～100 g-DCW•L-1)诱导65 h后，发酵液中的总蛋白浓度分别为0.79 g•L-1和0.93 g•L-1，总酶活分别为70,332 U•mL-1和71,529 U•mL-1，约为重组子K1的50%。K-4-2诱导表达10 h后细胞失去活性，发酵失败。多拷贝串联hLYZ基因转化重组子的溶菌酶表达性能较低。

目前重组人溶菌酶的大规模生产还存在这样或那样的问题，但重组DNA技术发展日新月异，相信在不久的将来，会有高效表达的工程菌或工程细胞问世。美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面经验丰富，其拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系，以提高客户的目的蛋白表达水平。