人血清、血浆及相关液体样本中血清淀粉样蛋白A(SAA)测定

实验概要

本实验用试剂盒测定了人血清、血浆及相关液体样本中血清淀粉样蛋白A(SAA)的含量。

实验原理

应用双抗体夹心法测定标本中人血清淀粉样蛋白A(SAA)水平。用纯化的人血清淀粉样蛋白A(SAA)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血清淀粉样蛋白A(SAA)，再与HRP  标记的血清淀粉样蛋白A(SAA)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP  酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血清淀粉样蛋白A(SAA)呈正相关。用酶标仪在450nm  波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人血清淀粉样蛋白A(SAA)浓度。

主要试剂

1. 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶
2. 酶标试剂 6ml×1 瓶
3. 样品稀释液 6ml×1 瓶
4. 显色剂A 液 6ml×1 瓶
5. 显色剂B 液 6ml×1/瓶

6. 终止液 6ml×1 瓶

7. 标准品（1600μg/L） 0.5ml×1 瓶

8. x 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶

主要设备

1. 酶标包被板 12 孔×8 条

2. 说明书 1 份

3. 封板膜 2 张

4. 密封袋 1 个

实验材料

标本要求
1. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融；
2. 不能检测含NaN₃ 的样品，因NaN₃ 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

实验步骤

1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
800μg/L 5 号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液
400μg/L 4 号标准品 150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液
200μg/L 3 号标准品 150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液
100μg/L 2 号标准品 150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液
50μg/L 1 号标准品 150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液
2.   加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5  倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
4. 配液：将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此
重复5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。
操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD  值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD  值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值大于标准品孔第一孔的OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。