基本方案 1 NK T 细胞的鉴定材 料外周肝素抗凝血 P B S R P M I -1640 培养基，含 1 0 % (V /V ) 人血清或 F C S 以 及 10U /m l I L -2 (可选） 流 式 细 胞 缓 冲 液（flow cytometry buffer， FCbuffer) : 含 1 % (v/V ) 人 血 清 、1 % (V / V ) FBS 和 0. 1 % (m /V ) 叠氮钠的 PBS 荧光素标记的抗 V a 24 单 抗（cloneC15B 2 ， P E 或 FITC 标 记 ， Coulter-Immunotech) 荧光素标记的抗 V p i l 单 抗（clone C 21D 2, P E 或 F I T C 标 记 ， Coulter) 突光素标记的同型对照抗体（BDPharmingen) 突光素标记的抗 6B 1 1 单 抗（B D Pharmingen; 可选） Cy5 标记的抗 C D 4 单抗、 Cy5 标记的抗 C D 8 单 抗
（BDPhanningen，可选） 荧光素标记的抗 C D 161 单 抗（Coulter，推荐使用） 荧光素标记的其他相关抗体（可选） 含 4 % 甲醛的 PBS (P B S w ith 4 % paraformaldehyde， P F A ) : 配制时置通风橱中，加热 至 80°C ， 可搅拌以加速溶解，冷后分装，一 20°C 保存 0.5m l 微量离心管或 9 6 孔细胞培养板 流式细胞仪 1 . 准备人外周肝素抗凝血（5〜10 ml) ，根据情况，室 温 可 保 存 I d 。 Ficoll-Hypaque 密
 基 本 方 案 2 免 疫 磁 珠 法分 离 NK T 细胞及后续扩增本法可从几毫升的外周血中分离和扩增 N K T 细 胞（< 1 0 000 N K T 细胞），浓缩白 细 胞（分离血小板时的副产品）也可作为 N K T 细胞的来源。 材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)外周肝素抗凝血 P B S ，含 2m m o l / L E D T A (附录 1) 未标记的抗 V 〇 t 2 4 单 抗（Coulter) 未标记的抗 6B 1 1 单 抗 ，即 抗 TCRot 单 抗（B D Pharmingen)
 备 选 方 案 I N K T 细胞的流式分选及扩增附 加 材 料
备 选 方 案 2 NK T 细胞的克隆附 加 材 料（其 他 材料见基本方案 1 和 2) 1T 细胞克隆培养基： R P M I -1640，含 1 0 % (W V ) 自体人血清、 20U /m l I L -2 及20U/ml IL-7植物血凝素 (phytohemagglutinin-P ， P H A -P ; Difco) 1.Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离 T O M C (单 元 8.1)。取出部分细胞，照射灭活后用作饲养细胞。 2 . 剩余细胞用 P B S 洗涤一遍，加 入 含 1 0 % 人血清的 P B S 重悬细胞，调 整 浓 度 为 IO8个细胞/m l ，冰 浴 15 min。 3 . 加入荧光素标记的抗 V a 2 4 单抗和另一种荧光素标记的抗 V p i l 单 抗（或标记的抗6B 11 单抗，推荐使用），终浓度均为 IOiU g A n U 冰 浴 30 min。同时，取部分细胞加入相应的同型对照抗体。 4 . 在 9 6 孔 圆 底 培 养 板 中 加 入 IO5 照 射 灭 活 后（5000rad) 的 自 体 饲 养 细 胞 和 P H A - P(终 浓 度 2ug/ml) ，补 充 T 细胞克隆培养基至终体积 0.1m l 。同时用流式分选仪分选V a24+ Vpll+ (或 6B 1 1 + ) 双阳性细胞，分选出的细胞应直接加入上述 9 6 孔板中。 5.—周后，每孔加入 0.1 ml T 细 胞 克 隆 培 养 基（不 含 P H A -P )。显微镜下观察细胞生长情况： 10〜M d 后 ，阳性孔中会出现一个或多个母细胞克隆（母细胞 圆 形 ，体积较大，每个克隆细胞数超过 100 个）。 6 . 根据克隆生长情况，每 隔 2〜3d 用 T 细胞克隆培养基传代。如果用自体血清进行 T克隆，当细胞扩增后，每次传代时培养基中增加 2 5 % 的异体人血清或 F B S ，直至完全取代自体血清。 7 . 当细胞数量足够时，用流式细胞仪检测不同克隆的 V a 2 4 和 Vpll ( 或 6B 1 1 ) 表达情况。 3 〜4 周 后 ，细 胞 可 进 行 二 次 刺 激 ，或 者 在 T 细 胞 克 隆 培 养 基 中 继 续 培 养 几 周 。 辅 助 方 案 NK T 细胞的二次刺激和克隆材 料
4.第 1 天 ，加入重组 IL-2 及 IL-7 各 50U /m l 。 5 . 第 5 天 ，用新鲜培养基进行半量换液，维持各细胞因子浓度为 50U /m l 。 6 . 第 1 0 天 ，在显微镜下观察 T 细胞克隆扩增情况。如果母细胞密度较高且培养基颜色变黄，用含细胞因子的扩增培养基将细胞进行 1 : 2 传代。对于生长旺盛的细胞，可每 隔 2〜3d 进行细胞传代。 经 过 2 周左右时间细胞可扩增约 1000 倍 。在无追加刺激的情况下，细胞可继续培养几周。 展开 | 