dna测序的方法有很多种.目前最常见的是双脱氧终止法了.在测序用的缓冲液中含有四种dntp及聚合酶.测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的a,c,g,t核苷三磷酸(称为ddatp,ddctp,ddgtp,ddttp),然后进行聚合反应.在第一个反应物中,ddatp会随机地代替datp参加反应一旦ddatp加入了新合成的dna链,由于其3位的羟基变成了氢,所以不能继续延伸.所以第一个反应中所产生的dna链都是到a就终止了;同理第二个反应产生的都是以c结尾的;第三个反应的都以g结尾,第四个反应的都以t结尾,电泳后就可以读出序列了.也许这样说你不一定明白.举一个例子,假如有一个dna,互补序列是gatccgat,我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dntp+ddatp,所以遇到g,t,c三个碱基时没什么问题,但遇到a时,掺入的可能是datp或ddatp,比如已合成到g,下一个如果参与反应的是ddatp则终止,产生一个仅有2个核苷酸的序列:ga,否则继续延伸,可以产生序列gatccg,又到了下一个a了.同样有两种情况,如果是ddatp掺入,则产生的序列是gatccga,延伸终止,否则可以继续延伸,产生gatccgat.
所以在第一个反应系统中产生的都是以a结尾的片段:
ga,gatccga,
同理在第二个反应中产生的都是以c结尾的片段:
gatc,gatcc,
在第三个反应中产生的都是以g结尾的片段:
g,gatccg
在第四个反应中产生的都是以t结尾的片段:
gat,gatccgat,
电泳时按分子量大小排列,a反应的片段长度为2,7;c反应的为4,5;g反应的为1,6;t反应的为3,8,四个反应的产物分别电泳,结果为
87654321
a||
c||
g||
t||
我们可以从右向左读,为gatccgat,至此,测序完成(上面这个图在百度知道中显示不正常,因为百度知道的网页用的是比例字体,你如果想看它,拷贝到记事本中,用等宽的字体来看).
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