从包含体中溶解大肠杆菌重组蛋白实验

分子克隆技术能够使细菌高水平表达蛋白，因此原核表达是一个非常便利的获得重组蛋白的系统。遗憾的是这些蛋白在细菌中易于聚合和沉淀，形成难溶解的包含体，因而很难纯化。非细菌蛋白的包含体尤其普遍。虽然没有一种可用于所有蛋白的普适方法，还是有许多策略适用于包含体蛋白的溶解。本方案描述的就是这些策略之一。溶解包含体蛋白时要考虑许多步骤：

①细胞裂解；

②包含体的分离；

③洗涤包含体；

④溶解包含体；

⑤重组蛋白的复性（假如需要）。

表达目标重组蛋白的细菌细胞

复性缓冲液 溶解缓冲液 洗涤缓冲液

离心机

①如实验方案6所述裂解细胞。

②4℃条件下23000g离心细胞裂解液30min。

③倒出上清，测定沉淀的湿重。

④用约10倍体积的洗涤缓冲液重悬沉淀，室温搅动悬浮液1h。

⑤4℃条件下23000g离心混合物30min。

⑥除去上清，并重悬沉淀。

⑦重复④〜⑥步骤3次以上（直到重组蛋白的纯度>80%）。

⑧溶解步骤⑦的沉淀物，每克湿重沉淀（由步骤③决定）加入约8ml的溶解缓冲液，在4℃条件下温和搅动混合物16〜20min。

实验提示：蛋白浓度不要超过2〜3mg/ml其他的溶解缓冲液：

a.8mol/L盐酸胍，10mmol/L DTT，50mmol/L Tris-Cl(pH8.5)

每12〜15g湿重的收集细胞用15ml溶液溶解。37℃孵育混合物1h。如步骤⑨a.所述变性蛋白。

b.8mol/L脲素，2mmol/L还原型谷胱甘肽/0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽。

每克湿重包含体沉淀使用9倍体积的缓冲液。室温孵育混合物1h。蛋白浓度不要超过2.5mg/ml。如步骤⑨,b.所述复性蛋白。

⑨特定目的蛋白的重新折叠所需的最适条件必须通过预实验来选择。复性条件包括：

a.用1.5μmol/L硫酸铜、50mmol/L Tris-Cl(pH8.5)溶液将可溶性沉淀稀释25倍，至终浓度为0.04mol/L DTT、0.24mol/L盐酸胍和约1.4μg/ml的目的蛋白。20℃孵育混合物2h。

b.缓慢将9倍体积的50mmol/L磷酸盐、50mmol/L NaCl和1mmol/L EDTA(含2mmol/L还原型谷胱甘肽/0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽）加入溶解的沉淀中。25℃孵育混合物2〜4h。

⑩用适合于目的蛋白的浓缩步骤来回收重折叠的蛋白（如RP-HPLC、冻干或超过滤)。

洗涤缓冲液：

100mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

2〜4.0mol/L脲

1%(体积分数）TritonX-100