从琼脂糖凝胶(Agarosgel)中回收DNA片段

实验概要

学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的基本技术。

实验原理

限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的 DNA酶切片段。

主要试剂

1. 电泳缓冲液

2. 荧光染料

3. 电泳级琼脂糖粉

4. 10´加样缓冲液

5. DNA分子量标准(DL2000)

6. DNA凝胶回收试剂盒

主要设备

1. 旋涡混合器

2. 微量移液取样器

3. 移液器吸头

4. 1.5ml 微量离心管

5. 双面微量离心管架

6. 台式离心机

7. 琼脂糖凝胶电泳系统

8. 微波炉

9. 恒温水浴

实验步骤

1. 配制TAE电泳缓冲液(10´储存液)，10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。

2. 操作步骤

   1) 用1´TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。

   2) 在胶上选定两个加样孔，分别加入少量(10μl)和大量(50μl )DNA酶切产物，电泳。

   3) 电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道(一般选择位于凝胶的边缘)，在紫外灯下找到目的DNA 带，用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意：含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用加荧光染料，也不用紫外灯照射！

   4) 将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶(尽量不要多余的凝胶)，转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。

   5) 按照DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。

纯化/回收试剂盒组成：

溶液A：6M NaClO₄，0.03M NaAc，pH5.2，少量酚红；

溶液B：3M NaAc；

溶液C：用时加入35ml无水乙醇；

溶液D：TE缓冲液。

胶回收步骤如下：

      a. 将切下的胶带放入1.5ml离心管中，按照1：3 (胶带重量：溶液A的体积)的比例加入溶液A；

      b. 50℃水溶10min，胶带完全要求完全溶化，其间可振荡助溶2～3次，待溶化后置室温加入15μl溶液B，充分混匀；

      c. 将溶液置于离心柱中，静置2min，10000rpm离心20s；

      d. 倒掉液体，加入500μl溶液C于离心柱中10000rpm离心20s，弃液体，重复该步骤一次；

      e. 12000rpm离心1min，甩干剩余液体以除去残余乙醇；

      f. 将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5～10min，使乙醇挥发殆尽；

      g. 加入20～30μl溶液D(使用前50℃水浴)，静置2min；

      h. 12000rpm离心1min，管底溶液即为所需DNA，将DNA贮存于-20℃可长期保存。