实验方法原理 在合成过程中，低浓度的放射性标记的 dNTP 使探针的长度限制为 200~300 个核苷酸。但是新合成的 DNA 可通过改变投入的模板量和 dNTP 的浓度使其长度为 100~1000 个核苷酸，如此长度范围内的探针适用于大多数杂交实验。
实验材料 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段寡核苷酸引物模板 DNA
试剂、试剂盒 洗脱缓冲液甲酰胺染色缓冲液NaOH探针合成缓冲液
仪器、耗材 聚丙烯酰胺凝胶空气孵箱或水浴摇床沸水浴一次性接种棒加热板塑料 snap-cap 管
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
洗脱缓冲液（1X SSPE 含 0.5% SDS）
甲酰胺染色缓冲液
MgCl2 ( 1 mol/L)
NaOH (10 mol/L)
3X 探针合成缓冲液（dATP、dTTP 和 dGTP ( 各 62 pmol/L），0.5 mg/ml 牛血清白蛋白（组分V，Sigma 公司），625 μmol/L DTT，32 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，6.5 mmol/L MgSO4）
2. 酶和缓冲液
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段
3. 凝胶
含 7 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺凝胶（5 %)
4. 核酸与寡核苷酸
寡核苷酸引物（M13 噬菌体通用引物或定制的寡核苷酸）
模板 DNA
5. 放射性复合物
[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，800~3000 Ci/mmol)
6. 专用设备
预热至 50℃ 的空气孵箱或水浴摇床
沸水浴
一次性接种棒
多孔（fritted) 柱（Quik-sep 柱，Isolab 公司）
预热至 57℃ 的加热板
塑料 snap-cap 管（12 X 17 mm)
二、方法
1. 在 0.5 ml 微量离心管中混合：
单链模板（M13 噬菌体或噬粒 DNA)
( ~0.15 pmol，~0.1 μg/μl） 0.3 μg
寡核苷酸引物 1 μl
25 mmol/L MgCl 1 μl
如可能，可在每次实验中设阳性对照反应，其中含有对照 DNA 模板或经实验证实反应良好的寡核苷酸。
2. 盖紧管盖，在 57℃ 加热板上温育反应物 5~10 min。
3. 将微量管从加热板移至冰上，再加入如下混合物：
3X 探针合成缓冲液 4 μl
10 mCi/ml [α-32P] dCTP
( 比活性 3000 Ci/mmol） 3 μl
Klenow 片段（约 2.5 单位） 0.5 μl
轻敲管壁以混合各组分，以最大速度离心 1~2s 使所有液体沉降到管底，37℃ 温育反应物 40 min。
4. 在进行引物反应的同时，可灌制含 7 mol/L 尿素的 5% 聚丙烯酰胺凝胶（用 1X TBE 缓冲液配制）。凝胶的厚度为 1.5 mm，长度至少为 15 cm，加样孔宽度为 2.5 cm。20~25 V/cm 电泳 15 min，以除去加样孔中的过硫酸胺。
5. 加入 25 μl 的甲酰胺染料缓冲液，在沸水浴中加热反应物 3~5 min，以终止引物延伸反应。将微量管移至冰上，加入 1 μl 1 mol/L NaOH。
6. 用注射器吸取 1X TBE 缓冲液，冲掉加样孔中的尿素和松散的聚丙烯酰胺凝胶碎片后，立即将 DNA 样品加至加样孔中。电泳 30 min，电压为 20~25 V/cm，使模板 DNA 与放射性标记探针分离。
7. 电泳 30 min 后，分离取下凝胶，将凝胶包在 Saran Wrap 包装膜中，通过放射性自显影定位放射性标记的 DNA。将凝胶在 X 线片上曝光 1 min。
8. 用清洁的剃须刀片从凝胶中切下有放射活性的区带，放入12 X 17 mm 的带弹性盖 (snap-cap) 的塑料管底部，用一次性接种棒捣碎后，加入 1~2 ml 洗脱缓冲液，50℃ 下振荡 >3 h。
9. 将洗脱液吸入多孔（fritted) 柱，将柱置于塑料 snap-cap 管，用台式离心机离心 1~2 min。用液体闪烁计数仪检测 1 μl 放射性探针的放射活性。