以含中间载体质粒的大肠杆菌材料为例进行介绍。
(一)中间载体质粒 DNA 提取(略)
(二)质粒 DNA 限制酶切及探针片段回收
1、操作
(1)限制性内切酶消化
在0.5mL Eppendorf 管中,按如下顺序及用量加入试剂,建立 20μL 酶切体系:无菌蒸馏水6μL,10倍缓冲液2μL,质粒 DNA10μL,限制性内切酶I 1μL,限制性内切酶Ⅱ 1μL,用手指轻弹管壁混匀,轻微离心,置37℃水浴中酶解过夜。
(2)琼脂糖凝胶电泳分离
①配制浓度为1.2%的琼脂糖凝胶。
②向酶切反应的离心管内加入 5μL 溴酚蓝溶液,混匀,点样。
③取 2μL 分子量标准 DNA 及 10μL 未经酶切的质粒 DNA,分别与 5μL 溴酚蓝混合上样。
④50V 电压,电泳1.5h,取出凝胶置紫外灯下,根据相对分子质量标准 DNA 的大小及泳动距离找出探针片段。
(3)探针片段回收
①在紫外灯下,用小刀片将含探针片段的条带切下,置 1.5mL 的 Eppendorf 管中。
②加入 0.1mL 无菌蒸馏水,用玻棒捣碎凝胶,加蒸馏水至体积为 0.5mL 左右,加入等体积的酚,涡旋振荡至无明显的块状物。
③将离心管置液氮中冷冻 5min,取出,室温放置片刻后置37℃水浴中融解。反复操作3次。
④涡旋振荡均匀,12000r/min 离心10min。
⑤取上清液,加入等体积酚抽提。
⑥取上相,加入等体积氯仿抽提。
取上相,加入2倍体积的无水乙醇,混匀,-20℃放置30min。
⑧13000r/min 离心20min,去上清液,沉淀吹干。
⑨加入适量(不多于10μL)无菌蒸馏水溶解 DNA,测定纯度及浓度,备用。
2、说明
回收方法有多种,可查分子生物学实验手册。下面为探针标记:
1)随机引物合成法制备32P 标记 DNA 探针
(1)试材:回收的探针 DNA 溶液(25ng/μL)。
(2)试剂
①DNA 聚合酶I Klenow 片段。
②500mol/L dNTPs 溶液。
③5倍缓冲液:250mmol/L Tris·Cl(pH8.0),25mmol/L MgCl2,10mmol/L DDT(二硫苏糖醇),1mol/L HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)(pH6.6),随机六核苷酸引物。
④BSA(不含核酸酶)。
⑤TE 缓冲液。
⑥0.2mol/L EDTA (pH8.0)。
⑦3000 Ci/mmol[a-32P]dCTP。
(3)操作
①取适量待标记的 DNA 溶液,置 0.5mL Eppendorf 管中,于温水浴中加热 2～5min,迅速转入冰水浴中,使之变性。
②取一只无菌硅化 Eppendorf 管,依次加入下列试剂:5倍 buffer 10μL,dNTPs 2μL,变性探针 DNA 溶液1μL,BSA2μL,[a-32P]5μL,DNA 聚合酶I Klenow 片段5μL,蒸馏水补充体积至50μL,温和地混匀,离心机轻轻离心一下,室温下放置一至数小时,进行标记反应。
③将反应管置沸水浴中煮沸2min,迅速转入冰浴中,加入 EDTA 至终浓度为20mmol/L,混匀,可不经纯化直接加入到杂交袋中,或置铅盒中于-20℃保存。注意标记物的半衰期。必要时进行纯化。
2)切口平移法制备标记 DNA 探针
(1)试材:回收的探针 DNA 溶液(0.02～0.05g/μL)。
(2)试剂
①1μg/μL DNA 聚合酶I。
②0.2ng/nL DNaseI。
③300μmol/L dNTPs 溶液。
④10倍缓冲液:500mmol/L Tris(pH7.2),100mmol/L MgSO4。
⑤0.2mol/L EDTA(pH8.0)。
(3)操作
①取 dATP,dTTP,dGTP 溶液各10μL,混合成 dNTPs 溶液。
②取一只 Eppendorf 管,依次准确加入下列试剂:蒸馏水18μL,dNTPs 混合物10μL;10倍缓冲液5μL,DNA 0.2μL,[a-32P]DCTP 7μL,DNase I 5μL,DNA 聚合酶I 5μL;总体积50μL,将内容物混匀,置15℃恒温条件下反应60min。
③加入5μL EDTA 溶液,混匀,终止反应。
3)32P标记的 DNA 探针的纯化
探针的纯化方法有多种,这里仅介绍 Sephadex G-50 柱层析纯化法和乙醇沉淀法。
(1)Sephadex G-50柱层析纯化
①试材:标记反应混合液。
②设备:液闪仪或盖革计数器。
③试剂:葡聚糖凝胶G-50。
④操作
a.处理凝胶及制备层析柱。
b.用移液器将标记反应混合液全部加到层析柱凝胶顶部。用0.1mL TE 或 TEN 缓冲液洗管,待样品液进入凝胶时,立即将洗管液加到凝胶上。
c.待洗管液进入凝胶时,随即用 TE 或 TEN 缓冲液进行洗脱。
d.洗脱液流出约 2mL 开始用小管收集洗脱液,每管3滴,用闪烁仪或手提式放射性监测仪测定各管的 cpm(测量仪器测量出的每分钟的β粒子数)值,第一个 cpm 峰即为标记的DNA 探针。
e.将第一峰的液体收集在一起,用于杂交,或置铅盒中于-20℃保存,备用。
比活性(cpm/μg)为:第一峰总计数(cpm)÷DNA(μg)
例:标记0.5μg DNA,第一峰共收集5管,每管200μL,各取1L计数,计数值分别是0.2×104cpm,1.0×104cpm,2.4×104cpm,1.0×104cpm,0.4×104cpm总计数为5.0×104×200=1×107cpm。
其比活性为:1×107cpm÷0.5μg=2×107cpm/μg
若计数器的计数效率为50%,则每分钟粒子的衰变数为:4×107cpm/μg
掺入率为:第一峰总计数/(第一峰总计数+第二峰总计数)×100%
(2)乙醇沉淀法纯化探针
①试剂
a.4mol/L 乙酸铵(pH4.5)。
b.0.67mol/L 乙酸铵。
c.67%乙醇。
②操作
a.向标记反应混合液中加入等体积的 4mol/L 的乙酸铵,涡旋混匀。
b.加入2倍体积的无水乙醇,混匀,冰浴上放置15min。
c.37℃水浴加热2min,不时轻轻搅拌,使沉淀下来的游离标记核苷酸重新溶解。
d.1200离心力离心15min,小心地吸出上清液转入离心管中。
e.加入0.5mL 0.67mol/L 乙酸按,混匀,用67%乙醇冲洗片状沉淀,12000离心力离心15min,小心吸出上清液。
f.用90%乙醇洗沉淀,离心,弃去上清液,真空干燥沉淀。
g.用 TE 缓冲液溶解标记 DNA 探针,备用。