传代细胞培养与观察

实验概要

了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。

实验原理

传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。

这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。

主要试剂

L磷酸盐缓冲液(PBS)

无钙、镁溶液

细胞消化液：0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTA

EMEM液

3%谷氨酰胺

0.5％台盘蓝染液等

主要设备

解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9xl0⁴Pa(15磅)灭菌30min备用。

此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。

实验材料

喉癌细胞

实验步骤

在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。

1. 营养液配制:

EMEM液                                90%

犊牛血清                                10%

双抗(1万单位／m1)                加至约100单位／m1

3％谷氛酞胺                           1m1

7.4％NaHCO₃                         调pH至6.8—7.0

2. 换液:

在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液。

3. 消化与分装

在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，轻轻摇动，将溶液倒出。重复上述动作。加入适量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml加0.5％胰蛋白酶液0.2ml）以盖满细胞为宜，置于室温，停留1—2min后，翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙)，如出现缝隙，即可倒去消化液；如末出现缝隙，则可将瓶翻回，继续进行消化，直到出现缝隙为让。此时，可倒去消化液，加入新配制的营养液20m1。然后用吸管吸取培养瓶中的营养液，反复吹打瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时，可继续轻轻地吹打细胞悬液，以使细胞散开。随之进行分装。

4. 培养

分装好的细胞瓶上，做好标志，注明细胞代号、日期。置于培养架上，轻摇使细胞均匀分布，以免堆积成团。然后置于37℃培养。

5. 观察

   1) 观察体外培养细胞的几个问题；

细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：

      a. 首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度

      b. 观察培养姬颜色变化及细胞是否生长。

      c. 如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照2)的描述进行。

      d. 观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。

   2) 细胞的生长阶段及其形态特征

传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。—般中层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将具分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：

      a. 游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数h。

      b. 吸附期(贴壁)：由于细胞的附壁持性，细胞悬液静置培养一段时间(约7—8h)后，便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。

       c.  繁殖期：培养l2h以后直到72h，细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以“十”的多少表示如下：

十：细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的25％以内有新生细胞。一般要观察3—5个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。

十十：细胞占瓶壁有效面积的25—75％以内具新生细胞。

十十十：细胞占瓶壁有效面积的75—95％具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。

十十十十：细胞占瓶壁95％以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。

从十十一十十十十为细胞的对数增长期(或称为指数增长期)。

       d.  维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。

       e.  衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。