传代细胞培养实验

实验方法原理 当初代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，进而扩展汇合，占满一切空间，此时需要进行分离培养。这一操作称传代或再培养。如拖延传代，细胞会因增殖过度，培养基营养枯竭和代谢产物积累而发生中毒。80%汇合或刚汇合细胞是理想传代阶段。

实验材料 细胞

试剂、试剂盒 Hanks胰蛋白酶EDTA培养液

仪器、耗材 吸管培养瓶

实验步骤

1.  吸除培养瓶内旧培养液；

2.  向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限；

3.  置温箱中2~5 分钟（或在室温中，把培养瓶放在倒立显微镜台上镜下观察），当发现细胞胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化；

4.  吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉；注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失；如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液；

5.  用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；吹打勿用力过猛，以免伤害细胞；

6.  计数板计数后（如非实验用，不计数亦可），把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

注意事项

1.  把握发了传代时机，已如前述，在80%~90%汇合阶段最好，过早传代细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳。

2.  消化时间要适度，过短细胞不易从瓶壁脱落，过长细胞可脱落流失。

3.  消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。

4.  各种细胞对消化反应不同，有的敏感，有的迟钝，因此应根据所用细胞特点制定适宜消化措施。有的细胞附着瓶壁不牢，用吸管可从瓶壁直接吹下来，但这样容易伤害细胞，细胞大片脱落掉，不易计数，应尽可能采用消化法分散细胞为妥。

5.  消化传代良好时，细胞受损害少，细胞悬液均匀，各分装样品中数量误差小，细胞生长增殖速度一致，实验结果可靠性大。