除详细的病史及测定血糖外，还必须具备Whipple三项标准：
①发病多在禁食或用力的情况下；
②注射葡萄糖或口服糖水后临床症状可迅速缓解；
③发作时在成人及儿童血糖低于3.0mmol/L。
对肾上腺及垂体疾病所致的低血糖，进行尿17-酮类固醇、17-羟类固醇、生长激素、ACTH测定，L亮氨酸试验、高血糖素试验等，以及颅骨平片或CT、MRI检查等协助诊断。
