体外哺乳动物细胞染色体畸变试验方法！

在加入或不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试样品中。用中期分裂象阻断剂（如秋水仙素）处理，使细胞停止在中期分裂象，随后收获细胞、制片、染色、分析染色体畸变。通过检测受试样品诱发体外培养的哺乳动物细胞染色体畸变的能力，从而评价受试样品的致突变性及其强度。

一、材料

⒈受试样品固体受试样品应溶解或悬浮于适合的溶剂中，并稀释至一定浓度。液体受试样品可直接使用或予以稀释。受试样品应在使用前新鲜配制，否则必须证实储存不影响其稳定性。

⒉阳性对照可根据受试样品的性质和结构选择适宜的阳性对照物，应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当不存在外源性代谢活化系统时，可使用的阳性对照物有甲磺酸甲酯( methyl methanesulphonate, MMS )、甲磺酸乙脂（ethyl methanesulpho-nate, EMS)、(mytomycin C )、乙基亚( ethyl nitrosourea, ENU)、硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）等。当存在外源性活化系统时，可使的阳性对照物有苯并（a)芘（benzo (a) pyrene，BaP )、环磷酰胺（cyclophosphamide）等。

⒊阴性对照水或水溶性溶剂，亦可使用二甲基亚砜(DMSO)，但浓度不应大于0.5%。

⒋细胞株可选用中国地鼠肺（CHL)细胞株或卵巢（CHO）细胞株、人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞。

⒌肝混合功能氧化酶混合液（S9混合液）。

⒍0.04％秋水仙素溶液。取40mg秋水仙素溶解于100m1无菌0.85%氯化钠溶液中，过滤除菌。

⒎0.075mol/L溶液

⒏固定液甲醇：冰醋酸=3:1，临用前配制。

⒐吉姆萨染液取吉姆萨染料3.8g，置玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加125 ml甘油，放入37℃温箱中保温48小时。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤,2周后使用，作为吉姆萨染液原液。使用时，取1份吉姆萨染液原液，与9份1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8)混合。

⒑磷酸盐缓冲液（1/15mol/L, pH 6.8)。使用时，取1份吉姆萨染液原液，与9份1/15mo1/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8 )混合，配成其应用液。

二、方法

⒈细胞培养与染毒。试验需在加入和不加入S9的条件下进行。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）中，放C02培养箱内培养。试验时吸去培养皿（瓶）中的培养液，加入一定浓度的受试样品、S9混合液（不加s9混合液时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中，根据细胞周期决定处理2～6小时。结束后，吸去含受试样品的培养液，用Hanks液洗细胞3次，加入含10％胎牛血清的培养液，放回培养箱，于24小时内收获细胞。于收获前2～4小时，加入细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，作用时间为4小时，终浓度为1ug/ml)。

⒉用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含10％胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1000～1200r/min的速度离心5～7分钟，弃去上清液。

⒊加入0.075mol/L KCl溶液7ml，用滴管将细胞轻轻地混匀，放入37℃水浴中低渗处理7分钟，加入2ml固定液（甲醇：冰醋酸3：1)混匀，以1500r/min速度离心5～7分钟，弃去上清液。

⒋加入7 ml固定液，混匀后固定7分钟，以1500r/min速度离心7分钟，弃去上清液。用同法再固定1～2次，弃去上清液。

⒌加入数滴新鲜固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥。用吉姆萨染液染色。

⒍选择 100个分散良好的中期分裂象，在显微镜油镜下进行读片。在读片时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视标位置及畸变类型。所有处理组、阳性和阴性对照组均需测定有丝分裂指数。每一剂量组应分析不少于500个分散良好的中期分裂象。

三、结果与分析

计算指标包括每个细胞畸变数、染色体结构异常百分率、各剂量组及对照组不同类型染色体异常数与频率等。分裂细胞数应分别统计，一般不包括在总异常频率中。

在下列两种情况下可判定受试样品在本试验系统中为阳性结果：①受试样品引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义，并有与剂量相关的增加；②受试样品在任何一个剂量条件下，引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义，并有可重复性。

阴性结果的判定需在％RS<20%（即已产生明显细胞毒性）的情况下未见染色体畸变率显著增加时方可作出。评价时应综合考虑生物学和统计学意义。