体外转录合成单链RNA探针

限制性内切核酸酶 RNA 聚合酶 胰腺 DNA 酶Ⅰ 模板 DNA

乙酸铵 牛血清白蛋白 DTT 乙醇 酚 氯仿 胎盘 RNA 酶抑制剂 醋酸钠 转录缓冲液 rNTP 溶液

琼脂糖凝胶 微量离心管 Sephadex G-50 离心柱 水浴

一、材料

1. 缓冲液与溶液

乙酸铵（10 mol/L）

牛血清白蛋白（2 mg/ml，组分 V，Sigma 公司）

DTT ( 1 mol/L)

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V)

胎盘 RNA 酶抑制剂（20 单位/μl）

醋酸钠（3 mol/L，pH 5.2)

10X 转录缓冲液（400 mmol/L Tris-Cl ( 37℃ 下 pH 7.5)，60 mmol/L MgCl₂，20 mmol/L 盐酸亚精胺（spermidine HCl )，50 mmol/L NaCl）

2. 酶与缓冲液

适当的限制性内切核酸酶

T3、T7 或 SP6 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶


无 RNA 酶的胰腺 DNA 酶Ⅰ (1 mg/ml)

3. 凝胶

琼脂糖凝胶（0.8%~1.0%)

4. 核酸与寡核苷酸

含 rATP、rCTP、和 rUTP 各 5 mmol/L 的 rNTP 溶液

rGTP ( 0.5 mmol/L)

模板 DNA



5. 放射性复合物

[α-³²P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 400~3000 Ci/mmol）

6. 专用设备

微量离心管（0.5 ml)

Sephadex G-50 离心柱，用 10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)平衡

预热至 40℃ 的水浴

二、方法

1. 用适当的限制酶消化超螺旋质粒 DNA 制备 5 pmol 的线性模板 DNA。取一小份消化的 DNA (100 ng) 进行琼脂糖凝胶电泳分析。如有必要，再补加限制酶继续温育，直至不再残存痕量的未消化 DNA。

2. 如必须用产生 3' 突出端的限制酶如 PstI 或 SstI，则应用噬菌体 T4 DNA 聚合酶在四种 dNTP 的存在下处理消化的 DNA 片段，以除去产生的 3' 突出端。

3. 用酚: 氯仿抽提及用标准乙醇沉淀纯化模板 DNA。将 DNA 溶解于水，使其终浓度为 100 nmol/L ( 如 3kb 质粒为 200 μg/ml)。

4. 将下列前六种组分温育至室温，在一个灭菌的 0.5 ml 微量离心管中，室温下以下列顺序混合：

模板 DNA                      0.2 pmol（3 kb 质粒为 400 ng）

无 RNA 酶的水              加至 6 μl

5 mmol/L rNTP 浓液       2 μl

100 mmol/L DTT            2 μl

10X 转录缓冲液             2 μl

2 mg/ml 牛血清白蛋白    1 μl

10 mCi/ml [α-³²P] rGTP  5 μl

( 比活性 400~3000 Ci/mmol)

轻弹管外壁以使各组分混合。然后加入：

胎盘 RNA 酶抑制剂（10 单位）                          1 μl

噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶（约 10 单位)  1 μl

轻敲管壁外侧使反应物混合，离心 1~2s 以使所有液体沉降到管底。37℃（T3 和 T7 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶）或 40℃（SP6 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶）下温育反应物 1~2 h。

5. ( 任选）如需全长转录物，可加入 2 μl 0.5 mmol/L rGTP，在适宜该聚合酶的温度下再温育 60 min。

6. 加入 1 μl 1 mg/ml 无 RNA 酶的胰 DNA 酶 I 以终止体外转录反应。轻弹管外壁以混合各试剂。37℃ 温育反应混合物 15 min。

7. 加入 100 μl 无 RNA 酶的水，通过用酚: 氯仿抽提纯化 RNA。

8. 将水相转移至一个新的微量离心管，用下列三种方法中的任一方法将放射性标记的 RNA 与不需要的小分子 RNA 和 rNTP 分开：

(1) 用乙醇沉淀纯化 RNA

① 在水相中加入 30 μl 10 mol/L 醋酸铵，混匀后再加入 250 μl 用冰预冷的乙醇。置 于冰上 30 min 后，在微量离心机中 4℃ 下以最大速度离心 10 min 收集 RNA。

② 小心地尽量吸去其中的乙醇，然后将管子敞开口，放置于实验台上数分钟，使剩余的可见的乙醇挥发干净。把 RNA 重溶于 100 μl 无 RNA 酶的水中。

③ 加 2 倍体积冰预冷的乙醇至小管内，将 DNA 贮存于 -70℃ 备用。

(2) 通过离心柱层析纯化 RNA

① 将 Sephadex G-50 离心柱平衡于 10 mmol/L Tris-Cl 中（pH 7.5) 灭菌处理。

② 用离心柱层析纯化 RNA。

③ 将洗脱的 RNA 贮存于 -70℃ 以备用。

(3) 通过凝胶电泳纯化 RNA

① 准备中性聚丙烯酰胺凝胶。

② 在水相中加入适当的凝胶上样缓冲液，通过凝胶电泳纯化 RNA。

③ 通过放射性自显影定位 RNA。

④ 用挤碎和浸泡的方法从凝胶块中纯化 RNA。

⑤ 将 RNA 贮存于 -70℃ 备用。