体外DNA重组技术3

【实验试剂与器材】

（1）Oligo(dT)纤维素

（2）层析柱装置

（3）1×上样缓冲液：20mM Tris.Cl (pH7.6)，0.5M NaCl，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.1%十二烷基肌氨酸钠(SLS)

配制方法: 用Tris.HCl、NaCl和EDTA母液，加入各成分确切含量后，15磅高压15分钟，待溶液冷却至65℃时，加入预先在65℃水浴30min的 10% SLS，至终浓度为0.1%。也可用0.05M柠檬酸钠代替Tris.HCl。然后用0.1%DEPC处理整个缓冲液。

（4）洗脱缓冲液: 10 mM Tris.HCl (pH7.6)，1 mM EDTA.Na2 (pH8.0)，0.05% SDS

先将Tris.HCl和EDTA混合后高压，然后加10%SDS至所需浓度，此缓冲液配制后不可高压。

（5）3M NaAc (pH5.2)

（6）DEPC (焦碳酸二乙酯,sodium acid pyrophophate)处理水：0.1% DEPC双蒸水，37℃摇动温育至少12h，然后15磅高压15min。

【实验方法与步骤】

（1）将0.5～1g的Oligo(dT)纤维素悬于0.1M NaCl溶液中，然后用0.5~1ml装柱；用3倍柱容积的DEPC-H2O洗柱，再用1×上样缓冲液洗柱，至洗出液pH<8.0；

（2）将RNA溶液在65℃加热5min，然后迅速冷却至室温，加入等体积的2× 上样缓冲液，混合后直接上样，并收集流出液。重复此过程2-3次以使mRNA更充分地结合到纤维素上；

（3）用2～3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱mRNA；

（4）加入1/10容积的3M NaAc (pH5.2)于mRNA洗脱液中，混合后加入2.5倍体积的冰冷无水乙醇，混匀后-20℃沉淀30min；

（5）10000×g，4℃离心15min，弃上清。用70%乙醇漂洗，10000×g离心5min，弃上清,室温蒸发乙醇；

（6）用适量的无RNase污染的水溶解mRNA。此mRNA可用于 Northern印迹，RT-PCR及核酸保护试验。若长期保存，可加入3倍体积的无水乙醇，置-70℃。

【注意事项】

（1）因为RNA易被RNase降解；整个操作不能有RNase的污染，同时要注意无菌操作。

（2）所有试剂的配制均用DEPC处理过的水

（3）加入3倍体积的100%乙醇于RNA溶液中，-70℃可长期保存.

（4）此RNA可用于第一股cDNA的合成，Northern印迹，核酸酶保护试验等。

三、质粒DNA的制备

【实验目的】

熟悉质粒DNA常用的制备方法
【实验原理】

转化细胞中的质粒DNA制备主要包括三个步骤：细菌的培养、收获和裂解、质粒的分离和纯化。低浓度的碱和SDS可以有效地裂解细菌的细胞壁，从而使质粒释放出来。

【实验试剂与器材】

1.细胞悬浮液: 50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl,（ pH8.0），10mM EDTA.Na2,（pH8.0）

2.细菌裂解液: 0.2mol/L NaOH，1% SDS

3.中和液: 60ml 5M醋酸钾，11.5ml 冰醋酸，28.5ml双蒸水

4.3mol/L NaAc (pH 5.2)

5.TE饱和酚 (pH8.0)

6.氯仿/异戊醇 = 24:1

7.RNase（20mg/ml）

【实验方法与步骤】

（一）质粒的小量制备:

1.将5ml LB培养液(含筛选抗生素)加入到容量为15ml并通气良好的试管中，然后将转化菌的一个单菌落接种于培养液中，37℃以225rpm速度振荡培养 14-16h；

2.10,000rpm，4℃离心5min，弃培养液；

3.用预冷的细胞悬浮液将菌体悬浮起来，室温放置5min；

4.加入细菌裂解液，上下颠倒微量离心管以裂解细菌，待溶液变黏稠为止；

5.加入中和液，上下颠倒混合后置冰上5min，12,000rpm，4℃离心5min；

6.将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的TE饱和酚/ 氯仿(1:1)混合液，振荡混匀1min，12,000rpm离心2min；

7.将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min，12,000rpm离心2min；

8.将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀15-30min，然后12,000 rpm离心15min；

9.弃上清，于沉淀中加入100?滋L双蒸水或TE(pH8.0)溶解沉淀，加入20?滋g/ml RNase，置室温30min，然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，振荡混匀1min，12,000rpm离心2min，将上层水相移至另一离心管中，加入0.1倍体积3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，置-20℃沉淀15~30min，然后离心15min；

10.弃上清，加入70%乙醇( 注意不要混合)，12000rpm离心10min；

11.弃上清，真空干燥或自然干燥质粒DNA；

12.用去离子水溶解质粒DNA，-20℃保存备用。