体外DNA重组技术5

（三）DNA酶切片段的回收

【实验方法与步骤】

1.冻融法:

（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，-70℃冷冻至少 15min，然后在65℃水浴中使胶融化；

（2）加入等倍体积TE-饱和酚，剧烈振荡30秒钟，然后-70℃冷冻 15min；

（3）室温融化后，12,000rpm离心5min，将上层水相移至另一离心管中，用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀DNA片段，离心后的沉淀用75%乙醇漂洗一次，室温干燥DNA，用双蒸水或TE缓冲液溶解DNA后，-20℃保存备用。

2.低熔点琼脂糖法:

（1）在UV灯下，用手术刀片在待回收DNA片段前方挖一槽，然后用同样浓度的低溶点琼脂糖将槽填平，继续电泳至待回收DNA片段进入低熔点琼脂糖中；

（2）在UV灯下，用手术刀片将含DNA的低熔点琼脂糖凝胶切下，37℃水浴 10min至凝胶融化为止；

（3）加入等体积的TE饱和酚/氯仿(1:1)抽提，12000rpm离心 5min；

（4）将上层水相移至另一离心管中，用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积 3mol/L NaAc(pH5.2)沉出、75%乙醇漂洗一次，晾干备用。

3.DNA回收试剂盒（玻璃乳法）:

（1）在UV灯下，从琼脂糖凝胶上切下含DNA片段的凝胶，放入一离心管中；

（2）加入3倍体积的6mol/L NaI溶液，45～55℃水浴5～10min使胶完全融化；

（3）加入10?滋l玻璃乳悬液，轻弹管底混匀，然后45～55℃水浴 5～10min，期间每2～3min混匀一次；

（4）5000rpm离心30~60秒，弃上清；

（5)加400?滋l漂洗液（20mM Tris.Cl，pH7.4/1mM EDTA/100mM NaCl和等体积无水乙醇），轻弹管底混匀，然后同上离心弃上清；

（6）再加入漂洗液，轻弹管底混匀，然后同上离心弃上清，并用加样器尽量除净漂洗液，然后室温晾干；

（7）加10~30?滋l无菌双蒸水或TE缓冲液将玻璃乳悬浮起来，45～55℃ 水浴5～10min；

（8）10000rpm离心1～2min，回收上清备用。

【注意事项】

漂洗玻璃毛时不可用加样器上下吹打，从玻璃毛上洗脱DNA时则相反。

五、载体与DNA片段的连接反应

【实验目的】

学习和掌握DNA连接酶的使用原则和基本方法

【实验原理】

DNA连接酶可以在两个双链DNA分子相邻的5'-磷酸与3'-羟基之间形成磷酸二酯键，从而可以实现重组DNA分子的构建。一般在连接反应之前，DNA分子都要进行限制性内切酶消化，使待重组的DNA分子具有相匹配的末端，黏性末端连接和平齐末端连接是最常用的，但不匹配的末端也可以经过修饰实现连接。
下面以质粒DNA为载体，介绍目的DNA片段与载体的连接。

黏性末端的连接涉及三种情况：①载体和DNA片段经双酶切后，两端具有不同的粘端，可以直接进行连接反应。②载体和DNA片段单酶切后，在DNA片段两端是互补的粘端。DNA片段插入载体时具有正反两个方向。③平齐末端连接需要在 DNA5'-端去磷酸化，否则线性载体DNA分子将发生自身环化连接。

（一）5'-端去磷酸化反应

通常只对载体DNA分子进行5'-端去磷酸化反应就基本可以避免自身环化连接。

【实验试剂与器材】

1.小牛肠磷酸酶 (Calf intestine phosphatase ,CIP)

2.10×CIP缓冲液

【实验方法与步骤】

1.酶切DNA反应，在75℃加热15min灭活酶活性；

2.10×CIP缓冲液和1U CIP，混合后，37℃孵育30～60min，然后75℃加热15min灭活CIP活性；

3.琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目的DNA片段用于连接反应。

（二）连接反应

【实验试剂与器材】

1.T4 DNA连接酶

2.10×T4连接酶缓冲液

【实验方法与步骤】

反应体系：

质粒DNA (0.5(g/?滋l) 2?滋l

DNA插入片段(300ng/?滋l) 5?滋l

10× 连接缓冲液 1?滋l

T4 DNA连接酶 1?滋l

加水至总体积 10ul

混合后置14～16℃水浴6～12h。

【注意事项】

1）通常DNA插入片段与载体DNA的摩尔比为3:1或2:1，需根据DNA分子量计算，而不取决于浓度；2）平齐末端连接时，插入片段的量要远远大于载体DNA的量，可以为5:1或更多，即使这样，连接效率仍然很低。3）有时DNA 一端是粘端，另一端是平端，这种连接与双酶切粘端连接相似；4）不匹配末端需要连接时，首先要将末端处理成平端，然后再进行连接反应。