体细胞克隆小鼠Oct4相关基因的不完全再活化

实验概要

大部分体细胞克隆小鼠能发育到囊胚阶段，但是在着床后就死亡了。Oct4基因对于维持胚胎发育全能性起着重要的作用。缺乏Oct4基因的小鼠胚胎能发育到囊胚阶段，但是因为它们缺乏全能性胚胎细胞，在着床后便死亡了。基于类似原因，我们推断由不同体细胞核移植获得的克隆胚胎因为Oct4之类关键胚胎基因的错误激活，导致了胚胎缺乏真正的全能性细胞。为验证上述假设，我们应用一种“硅方法”确定了一系列与Oct4基因表达情况相似的Oct4相关基因。我们分别检测了卵丘细胞克隆囊胚中Oct4及10个Oct4相关基因的表达情况。

实验步骤

1. UniGene 分析

根据小鼠Unigene基因数据用电子分析法确定Oct4相关基因。UniGene是定时更新的从不同器官、组织获得的表达序列标签(ESTs)的基因片段集合。之前，UniGene电子分析用来确定生殖细胞中表达增加的基因。可以在ftp://ncbi.nlm.nih.gov/repository/UniGene 查找小鼠UniGene数据库。每个UniGene集合是序列相似的基因的表达序列标签(EST)的集合。每项EST记录都与cDNA库信息相关，cDNA库包括其自身的基因序列与其所在的生物源(可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/lbrowse.cgi. ORG=Mm查到)。我们检查了为小鼠UniGene库提供数据的所有cDNA库，从而确定了105个与着床前胚胎、原肠胚、胚芽、成年性腺，包括发育期性腺、生殖细胞、ES细胞、胚胎癌细胞(EC细胞)的早期与后期妊娠胚胎后躯有关的cDNA库。我们已经排除了缺少相关生物源的少数几个cDNA库。

小鼠UniGene数据库把来自500个cDNA库的250亿ESTs序列分为8.8万个EST集合。我们感兴趣的105个cDNA库提供了约35万个ESTs数据。根据这些参数，我们能利用cDNA库的UniGene集合的六个或更多ESTs确定含有多能干细胞的组织的特定基因。我们限定电子选择标准，要求必须包含至少两个胚胎不同发育阶段的ESTs，胚胎阶段中必须包括着床前胚胎阶段。限定包括着床前胚胎阶段对于更好的选择Oct4类基因是必不可少的，而不会错误的选择特定细胞型或特定发育阶段特异性高表达的基因，例如精子生成或减数分裂时期特异性基因。

我们使用传统的Perl script方法确定了102个符合选择标准的UniGene 集合。EST序列用Sequencher 4.1.2归类。然后通过RT-PCR进行基因序列分析和表达分析，将UniGene集合缩小到66个。我们再通过更加严谨的RT-PCR，根据胚胎与干细胞基因表达情况，确定与Oct4基因发育表达情况更加接近的基因。最后，我们分析了单个着床前胚胎候选基因的表达情况，并选择了10个Oct4相关基因作为进一步的试验分析。

2. 胚胎RNA提纯、cDNA合成、PCR分析

胚胎收集在含100µl Trizol无RNA酶的微管中，然后转移入0.5ml EP管中用20µl氯仿5000g转速离心两次。总RNA在1.5µl GlycoBlue与等体积的异丙醇中沉淀。残存的DNA用无DNA试剂提取。RNA再次沉淀，用70%乙醇清洗，最后用2µl无RNA酶水溶解。首先用SMART PCR cDNA合成试剂盒合成与扩增cDNA。然后用QIAquick PCR提纯试剂盒提纯cDNAs，用100µl水洗脱cDNAs。用2%琼脂糖凝胶溶解PCR产物。

3. 原生殖细胞(PGSs)与胚胎组织分离

从10d(E10)的Oct4-GFP转基因小鼠胚胎分离出PGCs，然后用Becton Dickinson 细胞流式仪将细胞分拣到Trizol 液中。原肠胚的上胚层是从胚外组织发育来的。从E12不同性别胚胎中肾分离下性腺。用Trizol液从收集的组织中提取RNA，然后合成cDNA。

4. 卵丘细胞与ES细胞为供体细胞的克隆胚胎的发育

以卵丘细胞与ES细胞为供体细胞制备核移植胚胎。制备完后3h，重构胚在含10mM Sr2、5 µg/ml CB 无Ca² CZB液中培养5h。胚胎在体外培养96h，移植前发育情况用Hoffman相差显微镜观察，用单枚胚胎研究基因表达研究。

5. 胚胎培养

用HEPES-CZB作体外操作液，KSOM液作为培养液。