体细胞突变对胚胎发育的分化过程进行新的探究和定义

　　胚胎发育过程中人体造血系统发育在以前主要是通过显微镜观察来确定的。

　　近日，来自英国韦尔科姆基金会桑格学院研究所的Ana Cvejic研究组与Peter J. Campbell研究组合作在Nature杂志上发表题为Lineage tracing of human development through somatic mutations的文章，利用体细胞突变对人类造血系统的发育过程进行谱系追踪，对胚胎发育的分化过程的不同阶段进行了新的探究和定义。

　　人类胚胎发育始于受精卵分裂为卵裂球，然后形成内细胞团和滋养层。内细胞团进一步分化为上胚层（Epiblast）和下胚层（Hypoblast）。下胚层被认为主要产生胚外组织，而上胚层形成三个胚层：产生表皮和神经系统外胚层（Ectoderm），产生心脏、肾脏、肌肉和结缔组织的中胚层（Mesoderm）以及产生肺部和消化道的组成部分的内胚层（Endoderm）。造血系统细胞在出现妊娠后第16天，人类胎儿组织学研究表明，在怀孕第8周(Post-conception week，pcw)时90%的红系细胞来源于原条（Primitive streak）。胎儿中造血干细胞和祖细胞突变的积累可以用于深入了解人类胚胎以及胎儿时期发育的动态过程和造血系统功能的起源。作者们对来自人类胚胎的造血干细胞和祖细胞的单细胞衍生细胞群落进行全基因组测序，并对已知来源的组织进行深度靶向测序，从而建立起胎儿发育的系统发育树。

　　图1 造血干细胞与祖细胞系统发育树以及实验工作流程

　　作者们首先从怀孕后第8周以及第18周的两个正常男性胎儿中采集造血器官，并使用荧光活化细胞分选的方式分离出单个造血干细胞与祖细胞（图1）。作者们在体外扩增了单个造血干细胞与祖细胞，并通过全基因组测序将其测序深度增加至约15倍。在8周胎儿中作者们对单个造血干细胞与祖细胞来源的277个细胞克隆进行了测序。在18周胎儿中肝脏和骨髓都会支持血液的产生，因此作者们对两种来源的234个细胞克隆进行了测序。然后对这些深度测序的克隆进行系统进化树的构建。

　　随后作者们对该测序结果的敏感性以及特异性通过模拟进行评估。在对敏感性进行调整后，作者们对样品中的突变负担进行测量，发现在8周胎儿以及18周胎儿中，每个造血干细胞与祖细胞的单核苷酸变异量分别为25.5个突变以及41.9个突变。另外，作者们对构建的系统进化树进行了不对称性的分析，发现与先前的研究相一致的是，最近的共同祖先的两个子细胞贡献的不对称性具有相当大的差异，该结果表明此种不对称性并非是程序性调控的。

　　进一步的，作者们对发育过程突变获得时间点与发育事件的时间点相匹配（图2），与造血干细胞与祖细胞共享最少突变的组织可能是最先从产生造血细胞的祖先系中分离出来的，而更多的共享意味着后来逐渐进行的分化过程。用此方式，作者们对所有的胚胎以及胚胎外的组织的发育计时进行了组织，可以对发育过程中不同事件发生的时间点进行总结。在小鼠中，滋养层和内细胞团之间的分子分歧发生在8-16细胞阶段，但在人类中这一事件的发生并不确切清楚。作者们发现在8周胎儿体内此分歧事件发生在4-16细胞期，这与小鼠的发育过程类似。胚胎发育过程的另外一个重要事件是上胚层分化。作者们发现在上胚层分化时，至少有20种血液前系血统已经存在，这与最近对人类早期发育的体外观察结果一致。因此，该系统进化树的构建对于人类胚胎发育过程中关键事件的计时提供了确切的证据。

　　图2 发育过程中胚胎内与胚胎外的分化时间

　　作者们的数据表明，与内胚层和中胚层相比，外胚层的来源造血系统的祖先只有较少的贡献。而且8周胎儿在循环系统中捕获的原始血液来自下胚层，其体细胞突变与胚胎外、中胚层组织的体细胞突变有更高的相关性。

　　总的来说，该研究为未来通过使用自然发生的体细胞突变作为条形码对人类发育过程进行理解提供了一个可能的工作流程以及概念框架。