使用合成核苷酸作探针实验

核苷酸

SSC 焦磷酸钠 SDS

培养箱 水浴锅

1.  制备双份的转印细菌菌落或噬斑的硝酸纤维素滤膜（处理和干烤过）。

2.  在室温下用3× SDS / 0.1%SDS溶液500 ml 洗膜3~5次。

3.  然后在65℃洗膜至少1.5 h 以上直至过夜。

4.  在预杂交液中37℃预杂交1 h。

5.  在装有20 ml 以上的SSC杂交液的可封口的杂交袋中可移入多达20张的滤膜。

6.  在毎 个杂交袋中每毫升杂交液加入0.125 ng 至1.0 ng 的每种³²P标记的寡核苷酸。

7.  在以下给定的温度条件下寡核苷酸杂交14~48 h。

（1）14 碱基——室温

（2）17 碱基——37℃

（3）20 碱基——42℃

（4）23 碱基——48℃

8.  从杂交袋中取出滤胰，用6×SSC / 0.05%焦磷酸盐洗膜液在室温冼膜3~5次，每次 5~15 min。

9.  再用预热的洗膜液洗膜30 min。预热温度与寡核苷酸片段长度有关。

（1）14 碱基——37℃

（2）17 碱基——48℃

（3）20 碱基——55℃

（4）23 碱基——60℃

10.  如果滤膜高于本底放射性活性，则需要将洗膜温度升高2~3℃，并延长洗膜15~ 30 min。

11.  重新作放射自显影检测。但不得超过以下对应的温度：

（1）14 碱基——41℃

（2）17 碱基——53℃

（3）20 碱基——63℃

（4）23 碱基——70℃

12.  用塑料薄膜包裹滤膜，放好，使用增感屏在-70℃对X光片曝光14~72 h，双份滤膜均对X光片曝光，如果在同一位置出现曝光点，那么该位置对应的细菌菌落或噬斑为阳性。