使用扫描电镜观察细胞样品的制备方法

一、原理

超薄切片实际上是样品的二维切片，不能表达细胞的三维结构，而且在观察切片后所拍摄的显微照片时，容易造成错误的印象，用扫描电子显微镜( SEM )能直接观察标本表面的三维空间结构，真实地反映各种细胞表面和断裂面的形态特征，其照明源与透射电镜基本相同，由电子枪经聚光镜汇聚成极细胞的电子探针，电子探针受扫描发生器控制，在样品表面逐点逐线的扫描，样品被电子轰击所产生的二次电子被收集、转换、放大，在电视荧光屏上同步扫描成像。二次电子的发射量与样品的表面形态有关，从而在荧光屏上出现表面起伏的样品立体图像。扫描电镜细胞样品的预处理包括取材、固定、脱水等。

二、操作基本步骤

1 、取材

扫描电镜下观察的样品尺寸要求比较宽松，一般1cm3左右样品都能适合大多数扫描电镜观察。

2 、固定

铺片培养的细胞取出浸入 PBS 中，漂洗细胞表面。然后将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加 4 ℃ 预冷的 3% 戊二醛，在 4 ℃ 固定 2h 或过夜，吸出固定剂，用 PBS 浸洗 2 次，每次 10min ，再用 4 ℃ 预冷的 1% 锇酸。在 4 ℃ 固定 1h ，然后用 PBS 浸洗 2 次，每次 10min 。

3 、脱水

丙酮 / 醋酸异戊酯( 1 ： 1 )脱水 10min ，接下来醋酸异戊酯脱水 30min ，或用系列梯度酒精( 30% 、 50% 、 70% 、 80% 、 90% 、 95% 、 100% )脱水，每种浓度酒精通过 2 次，每次 15min 。

4 、干燥

以临界干燥法最理想，但必须要有专门的仪器临界点干燥器。当实验室不具备此种仪器时，可采用冰冻干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的关键是乙腈置换。样品经上述处理后，浸入 520% 的乙腈溶液中，然后依次更换 70% 、 80% 、 90% 、 95% 、 100% 的乙腈溶液，每次浸泡 15-20min ，最后再换 100% 乙腈。然后进行真空干燥。即将乙腈置换后的样品连同青霉素瓶一起放到真空镀膜台的真空装置内，抽低真空，一般需 30-50min 。样品干燥后，待其温度升至室温时再放气，取出样品。

5 、样品导电处理

用真空喷镀法。所用的仪器为真空喷镀仪，样品被安置在离蒸发源约 10-15cm 处的样品台上，样品进行旋转活动，先喷碳。后喷金，喷镀应均匀，完成后镜下观察。