使用HCExpressArrayKit进行杂交与检测实验

抗体稀释缓冲液杂交缓冲液增强缓冲液PBSPBSTTween 20洗涤缓冲液抗体

离心机和转头荧光微阵列扫描仪微阵列芯片水浴箱

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

抗体稀释缓冲液*

杂交缓冲液*

增强缓冲液

取 50 ml 增强缓冲液浓缩液*(含有叠氮化钠），加到 950 ml 去离子水中，用力混合 10s。

PBS(137 mmol/LNaCl，2.7 mmol/LKC1，4.3 mmol/LNa₂ HP0₄•7 H₂0，1.4 mmol/LKH₂P0₄，pH 约 7.2)

PBST

取 500ul Tween 20，加到 1LPBS 中，用力混匀 10s。

Tween 20

洗涤缓冲液

取 50 ml 洗涤缓冲液浓缩液*(含有叠氮化钠），加到 1.45L 去离子水中，用力混合 10s。

2. 抗体

初级抗体*

次级抗体

山羊血清*（含有叠氮化钠）

3. 离心机和转头

具有吊桶式转头的离心机

4. 专用设备

荧光微阵列扫描仪，激发波长为 532nm(用来检测 Cy3)

锥形管，50 ml(例如，VWR)

镊子

杂交盒（例如，Coming)

LiherSlips(Erie Scientific) 或同等物品

纸巾

点在玻璃介质上的微阵列芯片，由 cDNA、PCR 产物，或者 70bp 或更长的寡核苷酸组成

水浴或潮湿的培养箱，预设为 37°C、55°C 和 75°C**

5. 附加器材

HC Express Avray Kit(Digene Corporation)

*由 HC Express Array Kit(Digene) 提供。

**见第⑧步。

二、方法

1. 将印刷好的微阵列芯片放到杂交盒中，点样的一面向上。

2. 小心地将 LifterSlip 放在点样区域的上方。

3. 在杂交盒的每个加湿孔中，各加 10~20ul 水。

4. 在一个离心管中，加入 1~25ul 总 RNA(1~20ug）至 25ul 试剂盒提供的杂交缓冲液中，加 H₂0 使体积达到 50ul，涡旋 10s，混匀杂交混合液。

5. 将杂交混合液在 95°C 温育 2 min, 使其变性。

6. 立即将离心管以大于 8000 g 离心 5s。

7. 迅速将杂交混合液吸到破璃微阵列上的 LifterSlip 边缘，混合液就会均匀地分布在阵列上。

8. 将杂交盒密封，在 75°C 水浴或湖湿的培养箱中温育 3 h。
用于 cDNA 阵列，推荐 75°C 对于寡核苷酸阵列，应该用 65°C。

9. 将杂交盒从培养箱中取出，在室温下放董 5 min。

10. 将芯片和 LifterSlip 放到含有 35 mlPBST 的 50 ml 锥形管中，直到 LifterSlip 掉下来为止。

11. 将芯片取出，并转到另一个含有 35 mlPBST 的锥形管中，通过摇动、垂直运动，洗涤芯片 l0s。

12. 用镊子将芯片点样面向上，放到纸巾上晾干1min。将芯片放回到杂交盒中，在点样区域上方放一个新的 LifterSlip。

13. 取 5ul 初级抗体，加到 45ul 的抗体稀释缓冲液中，制成初级抗体染色溶液。

14. 将初级抗体染色液吸到破璃微阵列上的 LifterSlip 边缘，它就会均匀地分布在阵列上。

15. 将杂交盒密封，在 37°C 潮湿的培养箱中温育 1h。
这步溫育之后，不必将杂交盒恢复到室溫，就可以进入洗涤步骤。

16. 换新的 50 ml 锥形管和新的 PBST 缓冲液，重复 10~12 步。

17. 取 5ul 山羊血清和 2ul 次级抗体，加到 43ulPBST 缓冲液中，制备次级抗体染色液。

18. 将次级抗体染色液吸到玻璃微阵列上的 LiherSlip 边缘，它就会均匀地分布在阵列上。

19. 将杂交盒密封，在 37°C 潮湿的培养箱中再温育 lh。在温育过程中，将增强缓冲液预热至 55°C。

20. 将芯片和 LifterSlip 放到含有 35 ml 洗涤缓冲液的 50 ml 锥形管中，直到 LifterSlip 掉下来为止。

21. 将芯片转到另一个含有 35 mlPBST 的锥形管中，通过摇动、垂直运动，洗涤芯片 l0s。

22. 将芯片转到第三个含有 35 ml 预热的增强缓冲液的锥形管中，再洗涤 l0s。
将洗涤时间延长至超过 10s，会降低信号。

23. 将芯片转到第四个含有 35 ml 洗涤缓冲液的锥形管中，洗涤 10s。

24. 最后，将芯片转到一个干燥的 50 ml 锥形管中，以 100~200 g 离心 5~7 min，或者直到干燥为止。

25. 在微阵列扫描仪上扫描芯片，并分析数据。