使用NCBI设计引物的教程

引物设计是PCR实验的关键步骤之一。正确的引物设计能有效提高实验的成功率。NCBI提供了一些强大的工具来辅助引物设计，本文将详细介绍如何使用NCBI工具设计引物。

一、了解NCBI标记类别

在NCBI中，常见的标记符号通常以两个字母开头，后接一组数字。这些符号表示不同类型的序列，对于选择正确的模板序列至关重要。

1. NM_123456：mRNA序列，表示成熟mRNA的转录本。

2. NC_123456：基因组序列，表示完整的基因组分子，包括基因组、染色体、细胞器、质粒等。

3. NP_123456：蛋白质序列，表示蛋白质的氨基酸序列，通常是全长转录氨基酸序列，但也包括部分蛋白质序列。

注：以上序列编号中的“123456”是泛指。

二、引物设计原则

1. 长度：引物长度一般在15-30bp，常用的为18-27bp，不应大于38bp。

2. GC含量：引物的GC含量一般为40%-60%，45%-55%为宜。上下游引物的GC含量和Tm值要保持接近。

3. Tm值：引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间。

4. 3’端碱基：引物3’端一般不用A，避免出现3个以上的连续碱基（如GGG或CCC），避免引物3’端的互补、二聚体或发夹结构。

5. 碱基分布：碱基应随机分布，引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

6. Exon junction设计：尽量在外显子接合处设计引物，以限制基因组DNA的扩增。

7. 特异性验证：使用BLAST检索确认引物的特异性。

三、NCBI查找目标基因

1. 打开NCBI网页：访问NCBI网站。

2. 搜索目标基因：在搜索栏里输入基因名称和物种，选择“Gene”数据库，点击搜索。

3. 确认基因信息：检查搜索结果中的基因名称和物种信息，确认目标基因。

4. 获取核酸序列：在基因信息页面找到对应的核酸信息，点击获取mRNA序列。

四、使用Primer-BLAST设计引物

1. 访问Primer-BLAST工具：在NCBI主页上点击“BLAST”，然后选择“Primer-BLAST”。

2. 输入目标序列：

• 粘贴目标基因的FASTA序列。

• 或输入目标基因的RefSeq编号（如NM_123456）。

3. 设置PCR参数：

• PCR Product Size：设置期望的PCR产物大小范围。

• Primer Pair Specificity Checking Parameters：选择默认设置以确保引物特异性。

4. 设置引物参数：

   

   
   

• 引物长度：建议200bp以内，最好不超过150bp。

• Tm值：默认设定为60℃，与后续qPCR实验匹配。

5. 选择参考数据库：

• 针对mRNA序列设计引物时选择RefSeq。

• 针对基因组DNA设计引物时选择Genomes。

6. 选择物种：输入正确的物种名称，以提高引物设计的特异性。

7. 提交任务：勾选“Show results in a new window”，点击“Get Primers”按钮。

五、分析和选择引物

1. 结果页面：Primer-BLAST会生成多个引物对，显示其详细信息（序列、Tm、GC含量等）。

2. BLAST结果：查看每个引物对的BLAST结果，确保引物的特异性。

3. 选择合适的引物：根据Tm、GC含量、引物长度和特异性结果选择最适合的引物对。

六、引物设计各参数设定

1. 序列输入方式：

• 基因序列号，如NM_123456.2

• 文本序列（AGCT的DNA序列）

• 从文件中上传序列（Fasta格式）

2. 引物区域设定：指定上下游引物的区域。

3. 引物相关参数设定：设置引物长度和Tm值。

4. 参考数据库选择：针对mRNA序列选RefSeq，针对基因组DNA选Genomes。

5. 物种选择：输入正确的物种名称，以提高引物设计的特异性。

6. 显示结果：勾选“Show results in a new window”。

七、如何选择扩增引物对

1. 优先选择扩增片段短的引物对，提高扩增效率。

2. 选择其中一条引物跨两个外显子，避免基因组DNA污染。

3. 综合考虑引物参数，选择适合的引物对。

八、实验提示

1. 实验急需时，可以在不同位置选择两对引物，提高实验成功率。

2. 经常使用NCBI工具，建议注册一个NCBI账号。

参考文献

NCBI网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov