实验概要
Southern技术是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术。它可用于基因组特定DNA序列的定位,可以测定相关片段的同源性、可以从c库、基因组文库中筛选完整基因等。用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割,通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段,随后,使DNA在原位变性,并从凝胶转移至固相膜,用已知核苷酸片段加以标记作为探针,通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。下面分别利用光敏生物素试剂盒进行杂交的方法。
主要试剂
硫酸葡聚糖钠盐(可不用)、聚乙烯吡赂啉酮(PVP)、聚蔗糖、牛血清白蛋白(BSA)、100mM EDTA、3MnaAC、无水乙醇、电泳缓冲液、切变性鲱鱼精DNA(100ug/ml)
20×SSC溶液 氯化钠 3M 预杂交液 6×SSC
柠檬酸三钠 0.3M (含100ug/ul变性鲱鱼精DNA)
pH 7.0 5×Denhardt's 溶液
0.5%SDS
变性液 0.5M NaOH 中和液 1M Tris-HCl pH 7.4
1.5M NaCl 1.5M NaCl
封闭液 3gBSA溶于70ml水中,浓盐酸调pH至3.0,煮沸20分钟后,冷至室温,NaOH调pH至7.5,加入10ml以下缓冲液(1M Tris-HCl pH7.5,MgCl2 0.19%,NaCL 5.8%,Triton X-100 0.05ml)定容至100ml
50×Denhardt's 溶液 1%PVP 1M PBS NaCl 0.8% pH 7.4
1%BSA KCl 0.02%
1%聚蔗糖 Na2HPO4 0.144%
KH2PO4 0.024%
洗涤液
A: 2×SSC,250ml中含0.1%SDS B:0.1×SSC,250ml中含0.1%SDS
C:Tris-HCl 100mM pH 7.5 D:Tris-HCl 100mM
NaCl 1M NaCl 0.5M
MgCl2 2mM Tween 20 0.5% pH 7.5
Triton X-100 0.05%
亲和素-碱性磷酸酶溶液 Tris-HCl 100mM
NaCl 1M
MgCl2 2mM
Triton X-100 0.05%
pH 7.5
碱性磷酸酶 2-3单位/ml
底物溶液 Tris-HCl 100mM pH 9.5 终止液
NaCl 100mM Tris-HCl 10mM
MgCl2 5mM EDTA 1mM
主要设备
分子杂交仪、摇床、 烤箱、取液器、电泳仪、电泳槽
实验步骤
1. 转膜
1) 电泳
2) 切胶 在紫外下,切取凝胶有条带部分
3) 脱嘌啉0.25NHCl浸泡凝胶10分钟,蒸馏水洗胶(大于15kb的DNA片段转移时做此步骤)
4) 变性,变性液(0.5MNaOH、1.5MNaCl)浸泡凝胶2次,每次15分钟,蒸馏水洗胶
5) 中和,中和液(0.5MTris-HCl,pH7.0、3MNACl)浸泡凝胶2次,每次15分钟,蒸馏水洗胶
6) 平衡,凝胶在20×SSC中室温平衡10分钟
7) 转膜,取一塑料盒,将一干净玻璃板横架于盒上,盒中倒入10×SSC,作为转移缓冲液,将2张大小合适的滤纸用20×SSC溶液浸湿,放置于玻璃板上,作为滤纸桥
将处理好的凝胶切去多余部分并切下一角作标记,胶面反转放置于滤纸桥上,四周用Parafilm膜封闭,以防短路
剪取一块面积稍大于凝胶的硝酸纤维素膜(NC膜),以2×SSC溶液浸湿后置于凝胶上
剪取2块相应大小的滤纸,以2×SSC溶液浸湿后置于NC膜上
(滤纸、凝胶、NC膜、滤纸间都不能有气泡)
滤纸上面放一叠吸水纸,上面压一块玻璃板,再压上500g左右的重物,转移过夜
8) 烤膜,转移结束后,NC膜在与凝胶切角相对处,用铅笔做记号,用6×SSC溶液室温漂洗5分钟,以充分洗去沾上的凝胶成分,吸水纸吸干残余液体,室温晾干,NC膜用滤纸夹裹好,80℃烤膜2小时
9) 烤干的NC膜用2×SSC浸润。
2. 杂交
1) 封闭,将杂交好的NC膜用滤纸吸干,放入一新杂交袋中,用封闭液42℃封闭2-4小时(封闭液用量为4ml/50cm2膜)。
2) 预杂交,将上部浸润的NC膜装入杂交袋,加入预杂交液(0.2ml/cm2膜),使膜与预杂交液充分混匀,赶走汽泡,封口。65℃2-4小时。
3) 杂交,倾出预杂交液,加入杂交液(预杂交液+临用前变性的标记好探针,终浓度为1-2ng/ml)(0.2ml/cm2膜),65℃过夜。
4) 洗膜,用洗涤液A,B分别洗膜两次,每次洗膜液体积不少于250ml。
5) 反应,弃去封闭液,加入亲和素-碱性磷酸酶溶液,室温避光反应15分钟,轻轻震荡。取出膜,用洗涤液C,D分别洗涤三次,每次洗涤体积不应少于300ml,每次5分钟,振荡。
6) 显色,将膜转入新袋中,加入底物溶液(用量为4ml/50cm2膜)。封袋,避光放置,显色数分钟至数小时,以杂交带清晰,背景低为好。
注意事项
1. 在7操作中每层间应确保无汽泡存在。
2. 操作中吸水纸的大小应小于顶层滤纸,且不能于滤纸下的任何一层接触。
3. 烤片的作用在于使已转移条带更牢地结合于NC膜上。