克隆化基因体外合成蛋白质分析DNA蛋白质相互作用实验

含有所需结合位点的质粒DNA

35S标记的蛋白5×结合缓冲液10 mg mL poly (dl-dC) • poly (dl-dC)或其他的大分子载体 DNA加样缓冲液45%甲醇 10%乙酸EN3HANCE (Du Pont NEN)

1) 用合适的限制性内切核酸酶切割0.5μg含有结合位点的质粒DNA (假设一个5 kb 的质粒），产生一个长为150〜700 bp的片段，这个片段的大小和内切酶切出的其他片段的大小不同。用酚抽提及乙醇沉淀纯化。

2) 建立以下15μL的结合反应：

5μL H₂O

3μL5×结合缓冲液

5μL DNA (DNA 片段各 9 nmol/L)

1μL 10 mg/mL poly (dl-dC) . poly (dl-dC)

1μL³⁵S标记的蛋白

室温下温育20 min。

设立不含有DNA及含有非特异性DNA (即缺乏结合位点）的对照反应。

3) 加5μL加样缓冲液，立刻加样到5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上。进行电泳，直至溴酚蓝接近胶的底部（根据缓冲液条件，大约需要1〜4 h),不要让胶的温度高于室温。 胶的组成及缓冲液的离子强度可作改变，并且这些改变对于检测蛋白质-DNA的相互作用可能很重要。

4) 电泳结束后，将凝胶置于45%甲醇/10%乙酸中室温下固定1 h。用EN3HANCE处理胶1 h，干胶，然后进行放射自显影。

与更为常用的迁移率变动分析法中采用³²P 标记的DNA及不标记的蛋白质有所不同，这里介绍的分析方法一般用的是³⁵S标记的蛋白质与不标记的DNA。这个方法的主要优点是：任何突变蛋白质只要改变DNA模板就可以测定其DNA结合性质，并且可以检测其亚单位结构（如二聚体、四聚体）